Téma P08+09: Laboratorní diagnostika tuberkulózy a infekcí způsobených aktinomycetami, nokardiemi a spirochetami Ke studiu: Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Borrelia, Treponema, Leptospira (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, antimikrobiální citlivost, PCR, metody průkazu protilátek Ú 08/1: Mikroskopie acidorezistentních a částečně acidorezistentních mikroorganismů Zatímco acidorezistentní mikroorganismy (Mycobacterium) nelze barvit dle Grama, mikroby acidorezistentní pouze částečně (Actinomyces, Nocardia) mohou být Gramem obarveny, ale barví se nekonstantně, a také nabývají větvených filamentózních forem. a) Barvení (negativního) klinického materiálu barvicí metodou dle Ziehl-Neelsena Ziehl-Neelsenovo barvení se používá u mykobakterií (M. tuberculosis, M. leprae), ale také u některých parazitů (Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis). Acidorezistentní organismy se barví pouze při zahřátí, avšak zato je pak neodbarví ani kyselý alkohol (alkohol s minerální kyselinou). Poté je odbarvené pozadí obarveno kontrastní barvou. Z časových důvodů nebudete barvení provádět. Popište však alespoň barvicí proceduru – do následující tabulky zapište názvy činidel používaných při barvení 1. Během barvení se preparát , dokud 2. Činidlo je směsí a 3. Místo tohoto barviva lze použít také b) Mikroskopie mykobakteriální kultury ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si v mikroskopu (imerze, imerzní objektiv) mykobakteriální kulturu barvenou dle Ziehl-Neelsena. Zaznamenejte zejména přítomnost acidorezistentních tyčinek. Zakreslete pozorované. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). c) Mikroskopie kmenů aktinomycet a nokardií ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si mikroskopicky Gramem barvené sklíčko. Popište a zakreslete pozorované objekty. Povšimněte si velkého polymorfismu organismů (od kokovitého tvaru přes tyčinky až po vlákna, často větvená); grampozitivní, ale často až gramlabilní). Opět obrázek i popište. Úkol 08/2: Kultivace mykobakterií, aktinomycet a nokardií Kultivační nároky acidorezistentních a částečně acidorezistentních bakterií jsou velmi různorodé. v Pro Mycobacterium tuberculosis používáme tekuté (Šula) a pevné půdy (Ogawa, Löwenstein-Jenssen). Pevné půdy se liší od většiny půd používaných v bakteriologii, protože neobsahují agar; jejich „pevnost“ je dána koagulovanou vaječnou bílkovinou. Před kultivací je nutno vzorky mořiti. v Pro rod Nocardia postačuje běžný krevní agar. v Pro rod Actinomyces je nutný VL-agar a kultivace v anaerostatu či anaerobním boxu (viz P07), protože jsou anaerobní. a) Popište půdy pro kultivaci mykobakterií Název půdy tekutá/pevná barva poznámky b) Popište a zakreslete růst kolonií rodů Mycobacterium, Actinomyces a Nocardia na (v) daných médiích Baktérie Název půdy Přítomnost/nepřítomnost růstu, případně charakterizace růstu (charakterizujte růst vlastními slovy) Mycobacterium Actinomyces krevní agar VL agar Nocardia krevní agar VL agar Úkol 08/3: Určení citlivosti na antimikrobiální látky K léčbě mykobakteriálních infekcí se používají speciální léky zvané antituberkulotika. Liší se také způsob testování citlivosti: antituberkulotika se přímo přidávají do půdy. Zato infekce působené rody Actinomyces a Nocardia se léčí „normálními“ antibiotiky a citlivost se testuje „normálním“ difusním diskovým testem. a) Určení citlivosti mykobakterií na antituberkulotika Porovnáním s kontrolní zkumavkou odečtěte testy citlivosti kmenů mykobakterií na antituberkulotika. Antituberkulotikum Kontrola růstu Růst A/N Interpretace b) Citlivost na antibiotika u kmenů Nocardia a Actinomyces Z časových důvodů se neprovádí. Odečítalo by se jako běžné difusní diskové testy u jakékoli jiné bakterie. Úkol 08/4: PCR v diagnostice TBC Jelikož je kultivace mykobakterií obtížná, stává se PCR velmi důležitou diagnostickou metodou. Odečtěte výsledek PCR TBC (z prezentace), zapište a interpretujte výsledky Pacient č. Proužek vzorku Interní kontrola Interpretace 1 2 3 4 Úkol 08/5: Diagnostika lepry Lepra je nemoc, která stále postihuje miliony lidí v méně rozvinutých zemích. Její diagnostika je obtížná. Vyplňte následující tabulku. Toto zvíře se jmenuje Používá se k výrobě a tato látka se používá při Zdroj obrázku: http://www.1-costaricalink.com/costa_rica_fauna/nine_banded_armadillo.htm Lymeská borrelióza Společná tabulka pro úkoly 09/1, 2 a 3 Písmeno pacienta Krátký klinický popis (1–3 slova characterizující situaci) ELISA (Úkol 1) W. blot (Ú2) PCR (Ú3) (+/–) Závěr: konečná interpretace, dopor. případné léčby IgM IgG IgM (+/–) IgG (+/–) Abs. (+/–) Abs. (+/–) J K L M N Úkol 09/1: Průkaz protilátek proti Borrelia garinii metodou ELISA Odečtěte podle výkladu vyučujícího výsledek reakce u pacientů s podezřením na lymeskou borreliózu. Určujeme protilátky ve třídě IgG a IgM. V poli A1 (odpovídá důlku A1 v mikrotitrační destičce) naleznete hodnotu CAL (hraniční hodnotu; všechny hodnoty absorbance nad CAL jsou positivní, vše pod CAL budiž negativní). V polích B1 a C1 jsou kontroly. Pacienti označení písmeny J až N jsou v barevně označených polích. Zapište hodnotu CAL, zkontrolujte, jestli negativní a pozitivní kontrola je v pořádku. Pak odečtěte a vyhodnoťte výsledky ELISA reakce pro pacienty No. J, K, L, M, N (ty nepište sem, použijte hlavní tabulku nahoře). Hodnota CAL (důlek A1): Hodnota absorbance K+ (důlek B1): r K+ je OK r K+ není OK ß zaškrtněte, co platí IgM Hodnota absorbance K– (důlek C1): r K– je OK r K– není OK Hodnota CAL (důlek A1): Hodnota absorbance K+ (důlek B1): r K+ je OK r K+ není OK ß zaškrtněte, co platí IgG Hodnota absorbance K– (důlek C1): r K– je OK r K– není OK Úkol 09/2: Průkaz protilátek proti Borrelia garinii pomocí Western blottu U pacientů řešených v úkolu č. 1 se vzorky séra či likvoru testovaly také Western blottem. Odečtěte výsledky dle instrukcí. Pro odečtení reakce použijte kontrolní proužek. Diagnostické schéma je vždy stejné: ELISA je použita ke screeningu, Western blot ke konfirmaci jejích výsledků. Odečtěte Western blot u pacientů J až N a zapište výsledky do hlavní tabulky. Úkol 09/3: Diagnostika Lymeské borreliózy pomocí PCR Pomocí dané fotografie PCR produktu na agarózovém gelu zakreslete a zaznamenejte který z testovaných vzorků je pozitivní. Poté proveďte celkové zhodnocení všech tří úkolů a zapište závěr. Syfilis Původce syfilis, Treponema pallidum subsp. pallidum, NENÍ kultivovatelný organismus. Diagnostika závisí na stádiu nemoci. Úkol 09/4: Přímý průkaz syfilis. Přímý průkaz syfilis je možný pouze v případě zaslání vhodných vzorků do laboratoře. V některých stádiích nemoci však není k mání žádný vhodný vzorek pro tento účel. a) Rabbit infectivity test – RIT Zapište název králíka používaného pro tento test. (Je odvozen z tohoto souostroví: àààààààààà.) Exudát z podezřelého vředu je zpravidla vyhodnocován zástinovou mikroskopií a očkován do králičích varlat. Testované zvíře začíná trpět orchitidou 10 dní po naočkování. Název králíka: b) Mikroskopie v zástinu Podívejte se na mikrofotografii treponemat ze zástinové mikroskopie. Pro urychlení máte tento úkol již vyplněn. c) Přímá imunofluorescence Pro urychlení máte i tento úkol už vyplněn. 14b) princip 14b) výsledek (www.medmicro.info) 14c) (www.medmicro.info) Nepřímý průkaz syfilis Společná tabulka pro úkoly 15 a 16. Písmeno pacienta Krátká klinická charakterizace případu Úkol 15 screening Úkol 16 konfirmace Závěr: konečná interpretace, doporučení případné léčby RRR TPHA FTA-ABS ELISA WB IgM IgG IgM (+/–) IgG (+/–) Absor- bance (+/–) Absor- bance (+/–) A B C D E Úkol 09/5: Screening syfilis – RRR a TPHA Těhotné ženy a dárci krve jsou screeningově vyšetřováni rychlou reaginovou reakcí (RRR) a Treponema pallidum pasivní hemaglutinací (TPHA). Posuďte výsledky screeningu u předložené skupiny osob a stanovte, u koho je třeba ještě zajistit podrobnější, tzv. konfirmační (potvrzovací) vyšetření. Výsledky zapište přímo do tabulky. RRR: pozitivní je vyvločkování. TPHA: pozitivní je tvorba aglutinátu. Více viz praktikum J07. Úkol 09/6: Konfirmace syfilis – FTA-ABS, ELISA a Western blotting Vyhodnoťte výsledky FTA-ABS, ELISA a western blottingu (WB) u pacientů se suspektní syfilis (viz předchozí úkol). Spočítejte cut-off a porovnejte s ním hodnoty pozitivní a negativní kontroly a výsledky pacientů. V poli/důlku A1 je přítomen blank. Hodnota cut off (C1 + D1) / 2 Hodnota absorbance K– (pole/důlek B1): r K– je OK r K– není OK ß zaškrtněte, co platí IgM Hodnota absorbance K+ (pole/důlek E1): r K+ je OK r K+ není OK Hodnota cut off (C1 + D1) / 2 Hodnota absorbance K– (pole/důlek B1): r K– je OK r K– není OK ß zaškrtněte, co platí IgG Hodnota absorbance K+ (pole/důlek E1): r K+ je OK r K+ není OK Leptospiróza Úkol 09/7: Přímý průkaz Leptospira sp. Prohlédněte si morfologii leptospir kultivovaných na tekutém Korthoffově médiu po dva týdny. Pro test byla použita moč pacienta s podezřením na leptospirózu. Pro urychlení máte vyplněno. Kontrolní otázky: 1. Jaké vzorky se odebírají při podezření na TBC? 2. Jak dlouho trvá kultivace M. tuberculosis? 3. Proč je nutné moření před kultivací M. tuberculosis? 4. Za jakých podmínek a jak dlouho rostou aktinomycety a nokardie? 5. Z jakého důvodu se v diagnostice TBC prosazuje automatická kultivace? 6. Jaké je základní omezení diagnostiky spirochétových infekcí ve srovnání s běžnými bakteriálními infekcemi? 7. Pacientovi bylo odstraněno klíště přisáté asi 2 dny v popliteální jamce, lékař navrhl zároveň odebrat krev „na borrelie“ . Co tímto označením mínil a jaký nález lze v této souvislosti očekávat? 8. Proč je materiál, v němž byly metodou ELISA prokázány protilátky proti některé z borrelií, vyšetřen ještě western blotem? 9. Jaké vzorky připadají v úvahu pro přímý průkaz syfilis? 10. Má smysl testovat metodou PCR materiál od pacienta, který je séronegativní (nemá protilátky proti borreliím)?