NA STOPĚ PACHATELE Díl pátý: Gramnegativní zločinci II Mikrobiologický ústav uvádí Přehled lékařsky významných G - tyčinek Na začátek motto… Bylo nevlídno, že by PSAE ven nevyhnal… (PSAE – zkratka pro Pseudomonas aeruginosa) Přehled témat Kinická characteristictika – Pasteurellaceae Příběh první n Kubík je hodný kluk, ale jeho rodiče jsou členy jakési sekty a nechtějí Kubíka nechat očkovat. Nejraději by ho měli pořád doma, ale nakonec ho přece dali do školky… n Po měsíci ve školce začal být Kubík nachlazený, a nakonec se začal dusit a sípavě dýchat. Volali RZP, záchranáři už uvažovali o koniopunkci, nakonec ale nebyla nutná. Ukázalo se, že Kubík má zánět příklopky hrtanové – nemoc, která se dnes už moc často nevidí… Kdo to Kubíkovi udělal? n Viník: Haemophilus influenzae ser. b (Hib) n Hemofily jsou krátké gramnegativní tyčinky. Na rozdíl např. od enterobakterií nerostou na Endu, ale dokonce ani na KA, protože nejsou schopné získat z krvinek růstové faktory, které potřebují. n Hemofily patří do čeledi Pasteurellaceae společně s rodem Pasteurella (viz dále) Klasifikace hemofilů n Haemophilus influenzae n pouzderný typ b (Hib) n pouzderné typy a, c, d, e, f n neopouzdřené kmeny n Haemophilus parainfluenzae (mnohem běžnější a mnohem méně patogenní) n Haemophilus aphrophilus a mnoho dalších druhů n Haemophilus ducreyi, původce pohlavně přenášené choroby ulcus molle Patogenita hemofilů n Nejzávažnější hemofilové choroby jsou epiglottitis, meningitis a sepse. Způsobuje je hlavně Haemophilus influenzae, serotyp b. n Další časté choroby jsou otitis media a sinusitis (zde po Streptococcus pneumoniae a společně s Moraxella catarrhalis) n Velmi běžná je přítomnost hemofilů v krku, přičemž patogenní role je velmi pochybná. Zvlášť v případě Haemophilus parainfluenzae nepředpokládáme, že by byl patogenem. Hemofilové onemocnění Ulcus molle n Je to pohlavní choroba, vyskytující se především v subtropických a tropických oblastech Příběh druhý n Jana se zase jednou toulala v zahradách. Bohužel, jeden plot byl příliš rezivý a pes za ním příliš silný. Pes unikl ven a narazil právě na Janu. A tak skončila Jana s pokousanou nohou. n Majitelé prokázali, že pes je očkován proti vzteklině. Avšak v ráně se brzy objevil hnis. Ten pak byl poslán do laboratoře. A zločincem byla… Pasteurella multocida n Pasteurella multocida. n Je běžnou flórou v psích tlamách. n U člověka způsobuje zejména zhnisání ran po pokousání psem či jiným zvířetem. n Má podobný charakteristický pach, podobný hemofilovému, ale na rozdíl od něj roste na krevním agaru (nikoli však na Endově půdě) n Vypadá tam jako něco mezi streptokokem a enterokokem, ale je rezistentní na vankomycin, což obvykle mikrobiologa „trkne“. Klinická charakteristictika – gramnegativní nefermentující bakterie Příběh třetí n Pan Zápalka je pyroman. Nedávno na svou vášeň doplatil a nehezky se popálil. Nyní se mu popálenina zanítila. Leží na popáleninovém centru a je na tom velice špatně. Lékaři naštěstí pochopili, že běžná antibiotika jsou mu platná jako mrtvému zimník a provedli stěr. Díky tomu se podařilo najít cílenou terapii a pana Zápalku vyléčit – do doby, než zase něco zapálí a způsobí si další popáleniny. Kdo za to tentokrát může? U oslabených osob mohou způsobovat např. i zánět nehtového lůžka. Autokasuistika as. Zahradníčka Pseudomonády napadají i jinak zdravé lidi při porušení anatomické kožní bariéry. Infekce však bývá jen lokální. n 13. 1. 2006, pátek, Padang, Západní Sumatra, Indonésie: as. Zahradníček padá do nezakryté dešťové kanalizace s následkem poměrně velké rány sahající na tibiální okostici n O několik týdnů později: rána je intenzivně cítit pseudomonádou, která je následně z rány i vykultivována. Naštěstí je dobře citlivá n Terapie: lokální – ušní kapky otosporin (gentamicin + polymyxin B, obě složky účinné) n Terapie úspěšná Padang Příběh čtvrtý n Linda bylo ubohé děvče: trpěla vrozenou chorobou – cystickou fibrózou. n Její plicní surfaktant se lišil od surfaktantu zdravých lidí. A tak byla často nemocná. n Posledně to byl Staphylococcus aureus. Tentokrát to bylo jiné: původcem byla Burkholderia cepacia, jedna z G– nefermentujících tyčinek Nefermentující a cystická fibróza n Cystická fibróza je těžké, vrozené onemocnění plic s poruchou produkce normálního plicního surfaktantu. To vede ke změněným charakteristikám plic, včetně mnohonásobně zvýšeného rizika infekce n Nejčastějšími původci jsou Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia a Staphylococcus aureus. Kmeny zpravidla získají polyresistenci a mnohé děti umírají velmi mladé. Pár slov o metabolismu bakterií n Jak víte, klinicky významné bakterie používají zpravidla jeden ze dvou typů metabolismu: fermentaci a aerobní respiraci. n Escherichia coli, která má dost živin, ale málo kyslíku (i když jiných plynů si užije dost J) preferuje fermentaci glukózy i jiných cukrů. Je fakultativně anaerobní n Naopak pseudomonády mají kyslíku habaděj, ale živin málo. Volí tedy aerobní respiraci, která jim umožní to málo dostupných živin využít úplně. Bývají často striktně aerobní n Adaptace na vnější prostředí se projevuje i pigmenty – viz následující obrazovka. Pseudomonas jako striktní aerob (na rozdíl od jiných) n Pseudomonáda (I) je striktně aerobní bakterie, nikoli fakultativně anaerobní jako například Escherichia coli (kmen II), natož striktně anaerobní jako kmen III (Bacteroides fragilis, viz P 07). Diagnostika hemofilů a pasteurel Přehled metod použitelných k dopadení dnes probíraných zločinců n Přímé metody n Mikroskopie – pokud ji potřebujeme pro odlišení od bakterií jiné morfologie n Kultivace – nefermentující rostou na většině půd, Pasterurellaceae jsou mnohem vybíravější n Biochemická identifikace – u obou skupin; u nefermentujících je založena na reakcích aerobní respirace, vyžaduje ê teplotu a 2 dny kultivace n Antigenní analýza – zejména u hemofilů (Hib) Nepřímé metody se téměř nepoužívají Více ke kultivaci těchto bakterií n Hemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je narušit. Musíme je tedy narušit, například zahřátím (čokoládový agar), nebo paralelním očkováním stafylokoka (satelitový fenomén) n Pasteurely na krevním agaru rostou, na Endu však nikoli n G– nefermentující naopak rostou na všech běžných půdách (KA, Endo, Müller-Hinton) Odlišení čeledi Pasteurellaceae (diferenciální diagnostika) n Gramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií n Endova půda: jak již víme, rostou na ní z klinicky významných jen enterobakterie, příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující tyčinky, to tedy znamená, že Pasteurellaceae nerostou n Pasteurellaceae prozradí zápach a různé další vlastnosti (biochemické, citlivost na antibiotika) K diagnostice hemofilů a pasteurel n Pasteurely rostou na krevním agaru n Hemofily na krevním agaru růst neumějí, protože si neumějí „otevřít“ krvinku n Rostou tedy na čokoládovém agaru n Na KA rostou v přítomnosti takové bakterie, která jim krvinku „otevře“ (satelitový fenomén). Takovou bakterií je například zlatý stafylokok n Mají droboučké kolonie, proto se používá disk k odclonění ostatních bakterií (bacitracin, ale ve vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu) Satelitový fenomén n Jak už víme, hemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je narušit. Narušení může obstarat n zahřátí agaru (čokoládový agar) n přítomnost jiného mikroba n Satelitový fenomén představuje tu druhou možnost, jak může hemofil získat faktory z krvinek. Znamená růst hemofila pouze kolem stafylokokové čáry. n Kolonie jsou mrňavé, prohlížejte je důkladně! Detekce hemofilů Růstové faktory hemofilů n Hemofily vyžadují faktory z krvinek, avšak jejich potřeba konkrétních faktorů je specifická: n H. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD) n H. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin) n H. influenzae vyžaduje oba faktory. n Používáme disky s těmito faktory: jeden s faktorem X, druhý s V, a třetí se směsí obou. Test růstových faktorů hemofilů Antigenní analýza hemofilů n Antigenní analýza se u hemofilů provádí obdobným způsobem jako u jiných bakterií. Dnes jsou zpravidla k dispozici komerční soupravy, obsahující např. i latexové částice a další součásti n Dříve se využívalo jevu tzv. koaglutinace se stafylokokem, kdy aglutinát byl hustší díky navázání stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi Antigenní analýza hemofilů – demonstrace výsledku n Zapište výsledek aglutinace hemofilů dle obrázku (jde o kmen K): Detekce druhu Pasteurella typickým vzorcem citlivosti n Žádné gramnegativní bakterie nejsou citlivé na vankomycin. Vankomycin lze použít jen u grampozitivních, avšak zde je silný: všechny streptokoky a většina stafylokoků a enterokoků je citlivá. n Na druhou stranu, jen málo bakterií je citlivých na penicilin, zvlášť mezi G– tyčinkami. n Kombinace citlivosti k penicilinu a rezistence k vankomycinu je poměrně specifická pro rod Pasteurella. Testy antibiotické citlivosti n Hemofily nerostou na MH agaru n Zpravidla se používá Levinthalův agar (přefiltrovaný čokoládový agar), na kterém jsou zóny lépe viditelné než na klasickém čokoládovém agaru n V naší laboratoři se používá „hemofilový agar“, což je půda blízká agaru Levinthalovu Typická sestava antibiotik pro léčbu hemofilových infekcí Diagnostika gramnegativních nefermentujících bakterií Odlišení G– nefermentujících (diferenciální diagnostika) n Gramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií n Endova půda: jak již víme, rostou na ní z klinicky významných jen enterobakterie, příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující tyčinky; to znamená, že nefermentující zde rostou n Nefermentující od enterobakterií a vibrií odliší to, že nefermentují glukózu (např. Hajnova půda zůstává po kultivaci celá červená, nezmění vůbec barvu) K diagnostice nefermentujících n Pseudomonády se zpravidla poznají: n Mají typickou vůni (mladé kultury) n Tvoří pigmenty, nejčastěji zelené, někdy modré či rezavé. Nejlépe jsou viditelné na MH, ale trochu i na KA či Endově agaru n Mají pozitivní oxidázu n Ostatní nefermentující, případně sporné pseudomonády, musíme rozlišit biochemicky, například NEFERMtestem 24 Pseudomonády na MH agaru a ostatních půdách n Uvědomte si, že MH agar je sám o sobě téměř bezbarvý, resp. lehce nažloutlý. n Vše zelené, co vidíte na agaru, je výtvorem pseudomonády, resp. jejího pigmentu pyoverdinu n Na KA a Endu se tvorba pigmentu projevuje méně, ale projeví se také. Na těchto půdách je zato typický perleťový lesk kolonií. Hajnova půda pro detekci G– nefermentujících bakterií n Kmeny které rostou na Endově agaru mohou by to být G– nefermentující, Enterobacteriaceae či Vibrionaceae. n Typické pro G– nefermentující je chybění jakékoli změny na Hajnově půdě (zůstává červená, případná nahnědlá barva nevadí, je dána přítomností pigmentů) Oxidázový test u nefermentujících n Z nejběžnějších G– nefermentujících tyčinek má Pseudomonas oxidázu pozitivní, Burkholderia zpravidla také; Stenotrophomonas většinou ne a Acinetobacter také nikoli. NEFERMtest 24 n Pro přesnou biochemickou identifikaci G– nefermentujících užíváme většinou Nefermtest 24 (nebo podobný jiných výrobců). n Je to trojstrip (ne dvojstrip jako minulý týden) n Kód se tu tvoří poněkud jiným způsobem: n první číslice je 0 (oxidáza –) nebo 1 (oxidáza +) n dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C n sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro případné další rozlišení Atb citlivost nefermentujících n G– nefermentující naopak rostou ochotně na nejrůznějších médiích n Pro testování i léčbu používáme poměrně silná antibiotika, nevhodná pro léčbu infekcí způsobených běžnými bakteriemi n Většina z těchto antibiotik by měla tedy být vyhrazena jen pro léčbu infekcí (nikoli však kolonizací!) způsobených danými mikroby Typická sestava atb používaných proti nefermentujícím bakteriím Šlo by to i E-testem Obrázky hemofilů, pasteurel a gramnegativních nefermentujících bakterií Fotografie z databáze zločinců: Hemofily Ještě jednou satelit Pasteurella multocida Pseudomonas aeruginosa Další „nefermentující“: Pseudomonas fluorescens Burkholderia cepacia Burkholderia pseudomallei Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter sp. Konec Zánět středního ucha – otitis media n Častý u dětí (krátká vodorovná Eustach. trubice) n Původci: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis n U chronických se mohou uplatnit i některé gramnegativní tyčinky Nutno odlišit záněty boltce a zevního zvukovodu: tady je původcem hlavně Staphylococcus aureus (jako u jiných zánětů kůže), léčba lokálně např. framykoin kapky Otitis media Vyšetřování a léčba infekcí středního ucha n Léčba má smysl, pokud jde o skutečně prokázaný zánět (bolest, zarudnutí, horečka) a nereaguje na protizánětlivou léčbu n Lékem volby je amoxicilin (např. AMOCLEN), alternativou může být co-trimoxazol n Vyšetřovat výtěr ze zvukovodu má smysl pouze po provedené paracentéze (propíchnutí bubínku) n Jinak má samozřejmě smysl vyšetřit hnisavou tekutinu, která je při paracentéze odebrána