NA STOPĚ PACHATELE Díl devátý: Pachatelé stočení do spirály Mikrobiologický ústav uvádí Úvod: Z medické hymny „Diabetes mellitus, icterus et vomitus“ (Druhá sloka) Treponema pallidum Gonococcus ruber Ulcus molle, ulcus durum Molle est reparaturum Nos curabit … (doplní se jméno vhodného urologa či dermatovenerologa) Přehled témat Klinická charakteristika spirálních bakterií Příběh první n Růžence Flekové naskákaly po těle růžové skvrny. Vzpomněla si, že by to mohla být… No ano, to by odpovídalo, před několika týdny byla na táboře a několikrát během tábora měla klíště. n Obvodní lékař ji poslal na dětskou infekční kliniku, kde zkušená infekcionistka potvrdila, že opravdu s největší pravděpodobností jde o to, co si myslela Růženka. Pro jistotu ještě odebrala sérum na průkaz protilátek… Erythema migrans n Toto je obrázek erythema migrans studenta M. M., který laskavě souhlasil s využitím ve výuce Viníkem byla Lymeská nemoc – zoonóza, přenášená klíšťaty Příběh druhý (vymyšlený, ale základ vychází ze skutečného příběhu) n Když Lou zjistila, že „perník“ opravdu potřebuje, a čím dál víc, nebylo pro ni daleko k rozhodnutí vydělávat si vlastním tělem. Konec konců, sex měla vždycky ráda. n Když si zákazník připlatil, vyspala se s ním i bez kondomu, brala přece antikoncepci a samotné jí to víc vyhovovalo… n Pak se ale zamilovala a rozhodla se mít dítě. Vysadila antikoncepci a byla celá šťastná, Helmut bude určitě ten pravý otec… Příběh druhý – pokračování n A tak tedy Lou byla těhotná. Zároveň si ale našla vředy na genitáliích a gynekoložka jí odebrala krev na serologické vyšetření. To vyšlo pozitivní. Lou odmítla interrupci ze zdravotních důvodů, jednak se na vše přišlo dost pozdě, jednak touha po dítěti byla silnější. n Lou byla léčena, bohužel nevhodně zvoleným antibiotikem. Dítě se narodilo nemocné a po dvou týdnech zemřelo na sekundární klebsielovou sepsi Viníkem zde bylo n Treponema pallidum, původce syfilis n Syfilis je klasická pohlavní nemoc. Přenáší se výhradně sexuálně. Jde ovšem o systémové onemocnění – v pokročilých stádiích postihuje celé tělo postiženého člověka (gummata, disekce aorty, neurolues, psychické příznaky) n Některé poddruhy T. pallidum a některá jiná treponemata způsobují jiné choroby (framboesie – yaws, T. pertenue) n Některá treponemata jsou i nepatogenní Gramatická poznámka n Treponema je slovo řeckého původu. V řečtině je středního rodu a leží vedle slov jako je aróma, magma, sperma, smegma, miasma. n Ovšem současnost slovo Treponema (ale i třeba slovo plasma) rozkolísala, a proto se často používá i ženský rod (ta Treponema) n Slovenčina urobila všetkým historickým reminiscenciám dôrazný koniec, a preto všetky tieto slová sú v slovenčine ženského rodu. Průběh syfilis Průběh syfilis Terciární syfilis Syfilis Yaws (framboesie) Příběh třetí n Pan Krysařík byl pracovníkem firmy KVAK (Kocourkovské vodovody a kanalizace, a. s.) n Jeho denním chlebem byla údržba kanálů. Nebylo kanálu, který by neznal. Znal i zvyky potkanů, měl je docela rád a rozuměl si s nimi. n Přesto jednou došlo mezi ním a vůdcem tlupy potkanů k jakémusi nedorozumění a pan Krysařík byl kousnut do lýtka n Netrvalo dlouho, a pan Krysařík ležel se žloutenkou a krvácivými stavy v nemocnici… Tohle sice není pan Krysařík, ale jeden jeho venezuelský kolega s podobným osudem Viníkem je… Mikrobiologická charakteristika a diagnostika spirochet Spirochety Treponemata: jak pátrat přímo n Přímý průkaz se dělá zřídka už proto, že málokdy je co odebrat. Jen pokud má pacient(ka) zrovna tvrdý vřed, lze provést seškrab z něj. n Mikroskopie: Používá se nativní preparát – zástin. Zvláštností je, že ač jde o nativní preparát, používá se imerze (treponemata jsou velmi subtilní). Mimo to lze provést fluorescenční barvení n Kultivace ani biochemická identifikace se nepoužívají n Průkaz antigenu lze provést přímou IMF n Pokus na zvířeti: Existuje tzv. RIT – Rabbit infectivity test (test infekčnosti na králíkovi n PCR diagnostika se stává čím dál důležitější Přímý průkaz syfilis n RIT – Rabbit infectivity test. Z etických důvodů i z důvodu pracnosti se použití RIT minimalizuje. Zástin – hledají se zářící treponemata na tmavém pozadí n Přímá IMF – další, avšak pracná přímá metoda New Zealand Rabbit užívaný k RIT Zástinová mikroskopie Poznámky k mikroskopii n Setkáváme se s různými typy mikroskopie: n Nativní preparáty – používá se krycí sklíčko, nefixuje se, nepoužívá se většinou imerzní systém n Barvené preparáty – fixuje se, po obarvení se zpravidla prohlíží imerzí n Zástinová mikroskopie – jde o zvláštní případ nativního preparátu; většinou se však používá imerzní systém n Fluorescenční mikroskopie; pokud je fluorescenčním barvivem značená protilátka či antigen, nejde o fluorescenci jako takovou, ale o imunofluorescenci; ta už je kombinací mikroskopie a serologie n Více najdete v bonusovém materiálu Imunofluorescence Treponemata: jak pátrat nepřímo n Používají se netreponemové testy, kde antigenem je zpravidla kardiolipin z hovězích srdcí, a treponemové testy, kde antigen je získán opravdu z Treponema pallidum n Diagnostika se skládá ze screeningu a konfirmace. Konfirmuje se vše, co ve screeningu vyšlo pozitivní či aspoň hraniční, a dokonce i to, co bylo negativní, je-li důvod. n Screeningově se zpravidla použije jeden netreponemový a jeden treponemový test n Konfirmace se provádí pomocí velmi spolehlivých treponemových testů Přehled nejdůležitějších nepřímých testů na lues RRR a TPHA n U RRR je pozitivní důlek se zákalem (vypadá podobně jako pozitivní kontrola). Panelem je třeba příliš netřepat a nenaklánět! n TPHA: Jde o aglutinaci na nosičích – červených krvinkách. Bramboře podobný útvar je pozitivní, tečka negativní TPHA – připomenutí Připomenutí TPHA II (www.medmicro.info) TPHA – hodnocení: Indikace ke konfirmaci n Screeningové reakce se dělají při každém testování na syfilis (včetně např. těhotných, u kterých vůbec nikdo nepředpokládá, že by měly být pozitivní). Screeningové reakce se provádějí jen kvalitativně či semikvantitativně n Indikací ke konfirmaci je: n jakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek reakce RRR a/nebo TPHA n přítomnost suspektních lézí na těle, nebo anamnéza rizikového sexuálního styku – zde i v případě negativity obou reakcí ELISA, Western blot a PCR v diagnostice spirochet n Jak ELISA, tak i Western blotting a PCR jsou u spirochet používány podobně jako u jiných mikrobů – viz témata J10 a J11 v jarním semestru. n Pozitivní jsou pacienti s hodnotami absorbance vyššími než daná hodnota (kalibrační důlek, cut off a podobně) n Průkaz IgG a IgM je zásadní, pouhá pozitivita IgG znamená jen důkaz prodělané infekce. n PCR se používá v diagnostice syfilis i Lymeské pomoci. Obvykle je pozitivní dříve, než průkazy protilátek Borrelie a leptospiry – průběh pátrání n Borrelie: Především sérologie, popř. PCR. Sérologií se stanovují IgM (svědčí pro časnou infekci) a IgG protilátky metodou ELISA, pozitivní nález se ověřuje Western blotem. Western blot je specifičtější metodou. n Leptospiry: Používá se zástinová mikroskopie (viz jarní semestr) a kultivace ve speciálním médiu. Diagnostika leptospir n Mikroskopický průkaz leptospir Další diagnostické možnosti u leptospir (latexová aglutinace) Obrázky spirálních bakterií Galerie zločinců: Borrelia burgdorferi Borrelia recurrentis Treponema pallidum Leptospira interrogans Leptospira interrogans Leptospira interrogans Leptospira v elektronovém mikroskopu Konec BONUS: Rozšířené povídání o mikroskopii bakterií n Bakterie jsou dobře viditelné v elektronovém mikroskopu, v praxi se nevyužívá n V optickém mikroskopu jsou viditelné mizerně. Lépe je vidíme, pokud se pohybují n Nemůžeme však spoléhat na pohyblivost bakterií. Zviditelníme je proto jinak: fixujeme je a obarvíme některou z barvících metod n Světlolomné bakterie, zejména spirochety, s výhodou pozorujeme pomocí zástinové mikroskopie Příprava preparátu n Pro zdárné mikroskopování je nutno připravit kvalitní preparát. n Preparát je nutno připravit tak, aby byly bakterie i ostatní objekty dobře viditelné. Nátěr nesmí být příliš řídký, příliš hustý, při fixaci se nesmí spálit aj. U nativního preparátu včetně zástinové mikroskopie je třeba zachovat mikroorganismy životaschopné. n Špatně připravený nátěr obsahuje různé artefakty, jednotlivé objekty jsou špatně viditelné apod. Části mikroskopu – dopadající světlo n Světlo prochází ze zdroje světla přes kolektor a kondenzor. Kvalitu a množství paprsků ovlivňuje n intenzita napětí zdroje světla n irisová clona kolektoru (v dolní části mikroskopu) n nastavení výšky kondenzoru n nastavení clony kondenzoru (apertura) n Výška kondenzoru se obvykle nastaví při zaclonění. V jednom okamžiku okraj clony přestane být modrý a začne být červený – to je ten správný moment. Pak se clona zase rozevře. n Je také třeba dbát na správné centrování obrazu. Při centrování se používají dva drobné šroubky, které jsou z boku na kondenzoru ve vzájemném úhlu 90° Kondenzor u normální a zástinové mikroskopie n U normálního mikroskopu je cílem kondenzoru pouze soustředit paprsky tak, aby ideálním způsobem a v ideálním množství dopadaly na preparát n U zástinové mikroskopie je kondenzor uzpůsoben speciálně tak, aby paprsky dopadaly zešikma. Paprsky, které by byly rovnoběžné s optickou osou, jsou přitom zacloněny clonou. Zvětšovací optika n V mikrobiologii používáme zpravidla binokulární mikroskop s vyjímatelnými okuláry zvětšujícími 10× n Objektivy se používají 4×, 10×, 20×, 40×, 60× a imerzní objektiv zvětšující 100×. „Imerzní“ znamená, že mezi preparát a objektiv se kápne imerzní olej, jehož index lomu je bližší indexu lomu skla, než v případě vzduchu n Každý objektiv je u novějších mikroskopů opatřen nejen číslem zvětšení, ale také číslem, které informuje, na jakou hodnotu má být při jeho použijí upravena clona kondenzoru Zaostřování a vlastní mikroskopie n Aniž bychom se dívali do okuláru, přiblížíme makrošroubem preparát k objektivu na co nejtěsnější vzdálenost n Nyní, již pod kontrolou zraku preparát opatrně oddalujeme, nejdříve makrošroubem, pak i mikrošroubem, až se dostaneme na příslušnou hladinu ostrosti n V některých případech (hlavně u nativních preparátů) není jedna hladina ostrosti, ale je nutno stále přeostřovat na „dno“ a „hladinu“ prostoru vyplněného tekutinou Speciální mikroskopické techniky n Mikroskopie v zástinu – používá se u světlolomných objektů (např. spirochet). Na objekt dopadají paprsky zešikma a do oka dopadnou POUZE ty, které se na něm zlomí n Anglicky se jí říká „darkfield microscopy“ – mikroskopie v temném poli. Pozadí je tmavé, bakterie světlá n Mikroskopie ve fázovém kontrastu využívá fázový posun paprsku Čištění mikroskopu n Po každém použití imerzního oleje je nutno očistit objektiv gázou s alkoholéterem (méně vhodný, leč použitelný, je benzín) n Občas je nutno očistit i neimerzní objektivy, zejména pokud jsou potřísněny např. olejem n Při potřísnění je také nutno otřít mikroskopický stolek, zde stačí čtvereček buničité vaty s benzínem. Nečistota často ulpívá pod zařízením pro uchycení sklíčka