NA STOPĚ PACHATELE Díl dvanáctý: Pachatel v organizované skupině aneb Bakteriální biofilm Mikrobiologický ústav uvádí Na úvod My jsme skvělá flóra běžná k našemu člověku něžná osídlíme povrchy číháme tu na mrchy Scházíme se každý pátek za účelem tvorby látek z kterých vzniká biofilm pevnější než dub i jilm! (Píseň běžné flóry, in: O. Zahradníček – Advent v dutině ústní. Zkráceno) Přehled témat Klinické případy spojené s biofilmem Příběh první (tentokrát skutečný) n Muž, 58 let, v roce 2001 zaveden kardiostimulátor, v roce 2002 opakovaně hospitalizován na interním oddělení s teplotami nejasné etiologie, vzestup zánětlivých markerů n V hemokulturách prokázán S. epidermidis s.velmi dobrou citlivostí n Několikrát dlouhodobě přeléčován vysokými dávkami antibiotik v kombinacích (oxacilin, gentamicin, rifampicin, cefazolin, cefalotin, klindamycin) Příběh – pokračování n Zpočátku vždy dobrá odezva, poté se objevují ataky teplot i v průběhu terapie. n Při transesofageálním vyšetření nález vegetace na komorové elektrodě o velikosti 1,5 × 1,5 cm. n Kardiologové opakovaně odmítají odstranění kardiostimulátoru. Nasazena kombinace antibiotik oxacilin + gentamicin + rifampicin, pacient v dobrém klinickém stavu. n Znovu však dochází k vzestupu teplot a zvýšení CRP. Nasazena terapie vankomycin + rifampicin, po zlepšení stavu je pacientovi odstraněn trombus a vyměněna elektroda (pod clonou ATB), to vede k celkovému zlepšení stavu pacienta. Viníkem byl biofilm Příběh druhý n Michal byl 13letý kluk. Nenáviděl rodiče a rozhodl se udělat cokoli, co bude proti nim.. n Rozhodl se, že jedna z metod boje s rodiči by mohla být blokáda všeho, co po něm rodiče chtějí. n A tak si přestal čistit zuby, udržovat pořádek ve svém pokoji a dělat některé další podobné věci. n Brzy ho ale začaly bolet zuby. Musel k zubaři, který konstatoval těžký zubní kaz. Zubařka mu zuby spravila, ale také nemilosrdně trvala na tom, že si musí začít zuby zase čistit, jinak že bude mít problémy znova – ne jen s ní (a ostatními z generace „vraťte-se-do-hrobu), ale hlavně s vlastními zuby. Zločincem byl n …opět přerostlý biofilm. n V ústní dutině je biofilm normální. Je dokonce užitečný: normální ústní flóra se organizována ve formě biofilmu, a tak se může bránit vnějším vlivům včetně patogenních agens n Nicméně příliš přerostlý biofilm (jako výsledek příliš velkého množství zkonzumovaných cukrů a příliš malého čištění zubů) způsobuje, že biofilm se stává nepřítelem, místo aby byl přítelem pacienta. Základní charakteristika biofilmu Biofilm: co je to? n Biofilm je komplexní, organizovaná struktura n Skládá se z živých buněk (většinou bakterií) a hmot jimi produkovaných (většinou polysacharidů) n Není přítomen jen v živých organismech, ale i v prostředí. Například kámen, na které jsme uklouzli v létě v řece či rybníku, byl asi pokryt biofilmem. Biofilm je významný i například v potravinářství Vznik biofilmu n Na začátku je pevný povrch a plovoucí bakterie + n Bakterie adheruje na povrch n Následuje agregace dalších bakterií n Bakterie začnou produkovat polysacharidovou matrix n Až vznikne třídimenzionální struktura zvaná biofilm Biofilm může být jedno- či vícedruhový Vznik biofilmu v časovém sledu Význam tvorby biofilmu u bakterií Bakterie mohou lépe regulovat početnost populace – v rámci biofilmu se totiž informují produkcí určitých látek (tzv. quorum sensing) Bakterie se stávají odolnější vůči vnějším vlivům, např.: n desinfekčním prostředkům n antibiotikům n imunitní reakci hostitele n Biofilm tvoří jak bakterie běžné flóry (z hlediska organismu spíše pozitivní), tak i patogeny. Mechanizmy ovlivňující rezistenci k antibiotikům n Vliv povrchového náboje n Snížení růstové rychlosti n Penetrační bariéra n Nehomogenní matrix n Fenotypové odlišnosti n Intercelulární signalizace n Imunitní mechanizmy... Eradikace biofilmu n Antibiotická léčba často potlačí pouze symptomy infekce způsobené buňkami uvolněnými z matrix biofilmu a jejich interakcí s imunitním systémem, buňky uložené v.matrix biofilmu není schopna zasáhnout. n K eradikaci biofilmu je možno využít vysokých koncentrací ATB či jejich kombinací (např. ATB zátka katétru), pokud léčba selhává, je nutno vyjmout ložisko biofilmu Prevence n Katétry a kostní cementy s antimikrobiálními substancemi, např. n minocyklin n rifampicin n Proplachy katétrů n Dodržování pravidel asepse, správné dekontaminační postupy apod. Diagnostické a experimentální metody u biofilmu Diagnostické možnosti n Průkaz biofilmu fenotypovými metodami (Christensenova metoda, Kultivace na agaru s.kongo červení) n Průkaz biofilmu genetickými metodami n Stanovení citlivosti bakterií v biofilmu k.jednotlivým antibiotikům (MBIC, MBEC) Mikroskopie orálního biofilmu Vedle oficiálních metod pro průkaz biofilmu existují i další možnosti, jak zviditelnit biofilm. V případě orálních biofilmu: n Gramovo barvení umožňuje pozorovat shluky bakterií (G+ i G- ) a případně buňky makroorganizmu (epitelie apod.). Polysacharidové hmoty zůstávají nezbarvené. Kultivace bakterií tvořících biofilm Možnosti n Klasická kultivace v bujonu: Uvolní se bakterie v.planktonické formě. Bakterie ve formě biofilmu se uvolní málo nebo vůbec. Vzhledem k použití bujónu jako pomnožovací půdy nevíme nic o kvantitě (kontaminace × infekce). n Semikvantitativní metoda: Umožňuje nám zmapovat povrch katétru a semikvantitativně posoudit nález, nevypovídá však o bakteriích v lumen a bakterie se nemusí uvolnit z biofilmu. n Sonifikace: rozrušuje biofilm na povrchu i v.lumen katétru. Vyočkování určitého objemu vzorku je kvantitativní metoda, takže dává možnost posoudit množství mikrobů. Průkaz vlivu přítomnosti sacharidů na tvorbu zubního plaku n Princip pokusu je jednoduchý. Na plastovém důlku (který imituje povrch zubu) je kultivována jedna z ústních bakterií při různých koncentracích glukózy a po různě dlouhé časové úseky n Vzniklý biofilm je poté vizualizován genciánovou violetí a jeho intenzita je kvantifikována ve formě absorbance pomocí spektrofotometru Aby se zabránilo náhodné chybě, má vždy šest sousedních důlků stejné hodnoty koncentrace glc i času Staré a nové zkratky pro určování účinnosti antibiotik MIC – minimální inhibiční koncentrace je pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba MBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ a podobně. MBIC – minimální biofilm inhibující koncentrace MBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace MIC versus MBEC n Zatímco MIC je metoda určující minimální inhibiční koncentraci ATB u planktonické formy, MBEC zjistí eradikaci bakteriálního biofilmu. Vypovídá tedy lépe o skutečném účinku antibiotika na bakterie žijící ve formě biofilmu. n MBEC odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu (nepřítomnost živých buněk, nedochází ke změně pH média, důlek tedy zůstává červený) Rozdíly v MIC, MBIC a MBEC– porovnání Diagnostické možnosti II. n Hodnoty MBIC a MBEC leží často nad break pointem pro daná antibiotika (bakterie jsou k.nim rezistentní) n Hodnoty MBIC a MBEC jsou často dokonce několikanásobně vyšší než MIC n Mikroby v biofilmu jsou zpravidla rezistentní i ke kombinacím antibiotik, jedinou možností potom zůstává vyjmutí biofilmového ložiska (katétru, ale i kloubních náhrad, zubních implantátů apod.) Obrázky biofilmu Obrázky zločince Různé obrázky biofilmu Obrázky zločince Různé obrázky biofilmu Vývoj biofilmu Vývoj biofilmu, jiné schema Vývoj biofilmu Vývoj biofilmu, jiné schema Biofilm v řece Katetrový biofilm Biofilm v ileu Biofilm na protéze Biofilm utekl zubnímu kartáčku a stává se zdrojem kazu Biofilm Biofilm Biofilm Kvasinkový biofilm Kvasinkový biofilm Biofilm Konec Bonus: více o biofilmu Kde všude působí biofilm problémy n biofilm vzniklý na umělých površích v organismu člověka i zvířete (katetry, implantáty a podobně) n méně často biofilm na přirozených površích (zde si s tím organismus spíše poradí), ale i zde mohou být komplikace (zubní plak člověka, biofilm v žlázovém epitelu vemene u krávy) n a samozřejmě také biofilm na různých površích či v potrubních systémech mimo organismy, zejména ve vodárenství a potravinářství Materiály a místa Na čem se tvoří: n nerez n hliník n sklo n teflonu n guma n plasty Nejčastější výskyt: mrtvá místa výrobního zařízení n ventily n klouby n těsnění n apod. Jaké jsou možné problémy u průmyslových biofilmů n zdroj křížových, postpasteračních a poststerilačních kontaminací → znehodnocení potravinářských produktů, kažení potravin, popř. přenos nákaz potravinami n koroze kovových částí zařízení n turbulence protékajících tekutých materiálů v průtokových trubkách n snížení účinnosti a energetické ztráty v důsledku tvorby tepelné izolační vrstvy ve výměnících tepla Biofilm jako zdroj dalšího šíření n Poté, co se biofilm vytvoří, uvolňují se z něj mikroorganismy, které pak mohou kolonizovat zase další povrchy, takže biofilm vzniká na dalších místech n Neodstraněný biofilm tedy představuje potenciální riziko pro vznik biofilmu na jiných místech Účinnost na biofilm = účinnost na bakterie n Účinnost chemických látek na biofilm jako celek je dána zcela jinými mechanismy a vlivy než účinek na bakterie samotné. Často se právě uplatňuje povrchový náboj n Proto postupy méně účinné na jednotlivé bakterie mohou být účinnější na biofilm n U biofilmů v chirurgických ranách je například důležitější lokální ošetření rány (např. koloidní stříbro – povrchový náboj) než celkově podaná antibiotika Odstranění biofilmu (obecně) n Odstranění povrchu (výměna zařízení, části potrubí apod.) je samozřejmě radikální krok. Otázkou je, zda se biofilm nevytvoří znovu, bude-li nová část stejné konstrukce n K mechanickému odstranění biofilmu lze přistoupit, pokud to umožňuje situace n Z fyzikálních metod lze použít např. ultrazvuk n Chemická cesta je možná, je však nutné mít ověřeno, že příslušný postup (látka a koncentrace) na biofilm působí. Často se používají chlorové preparáty n Kombinace různých postupů je též možná Detergenty a desinfekce: možnost kombinace (v průmyslu) Účinná může být kombinace n působení detergentu, který rozpustí a rozruší organickou hmotu na povrchu biofilmu, následně n opláchnutí rozrušený biofilm odplaví, a tím obnaží mikroorganismy, a poté n desinfekční látka pronikne dovnitř biofilmu a inaktivuje přítomné mikroorganismy Nebo lze využít prostředků, které mají účinek detergentu i desinfekčního prostředku; problém je v tom, že vlastní desinfekční účinek detergentů je spíše slabý. Je možná prevence? n Šanci pro prevenci dávají materiálové vědy, zejména makromolekulární chemie n Povrchy nejsou stejně náchylné ke kolonizaci; méně náchylné jsou zpravidla hydrofobní povrchy. I jednotlivé plasty se liší n V medicíně se již používají materiály se speciální povrchovou úpravou, případně dokonce napuštěné antibiotiky (to ovšem nelze v potravinářství připustit) Shrnutí bonusového materiálu n Biofilm působí komplikace nejen ve zdravotnictví, ale i v jiných oborech n Nejčastějším dalším oborem, kde se biofilm uplatňuje, je potravinářství n I zde ovšem existuje významná souvislost s lidským zdravím. Biofilm v technologických zařízeních se může stát zdrojem kontaminace potravin, případně vody