Repetitorium jarního semestru
praktických cvičení z lék. mikrobiologie
­ metody lékařské mikrobiologie
Sepsal: Ondřej Zahradníček
Autorská poznámka: tento text není kompletním přehledem toho, co se v jarním semestru
v praktiku probíralo, zejména v něm nenajdete popisy konkrétních úkolů (ovšem ne že by po
vás někdo chtěl znát zpaměti, kdy se kam pipetuje kolik mililitrů).
Text chce být spíše teoretickým základem, který ovšem student bezpodmínečně musí doplnit
svými poznámkami z jednotlivých praktických cvičení. Vřele také doporučuji nahlédnout na
naše webové stránky www.medmicro.info.
Vzhledem k tomu, že text vznikl úpravou jiných textů, sloužících původně k jiným účelům, možná,
že v něm najdete i informace nadbytečné, za což se omlouvám. Některé ,,nadbytečné"
informace jsem ale v textu nechal schválně ­ myslím, že třeba přehled nejdůležitějších bakterií či
nejdůležitějších antibiotik se vám ještě bude hodit. Považuji však za poctivé zdůraznit, že tyto
zelené části nejsou předmětem zápočtového testu z lékařské mikrobiologie v jarním semestru.
Text je autorským vlastnictvím Ondřeje Zahradníčka a je určen k výukovým účelům, jeho použití
k jiným účelům je třeba konzultovat s autorem.
Úvod (společný základ většiny témat)
Bezpečnost práce v laboratoři
Při práci v laboratoři je třeba dbát zásad bezpečnosti, zejména se vyhýbat všemu rizikovému
chování. Hlavní nebezpečí jsou nebezpečí infekce a nebezpečí požáru. O druhém z nich
vypovídá následující píseň:
Řeknu vám to na rovinu: není žádná sranda
Když se ráno před labinu dostaví ta banda
U skříněk se porvou všici narvou si tam věci
A už dupou po světnici: Češi, Švédi, Řeci
Říkám že jsou hluční oni - Řeci ovšem zvláště
Všude dupou jako sloni, čmárají na pláště
Dimostenes sirkou škrtá, Christos ničí kličku
První, druhá, třetí, čtvrtá pryč je za chviličku
Jednou taky vytáhli si sklíčko z desinfekce
Zapomněli to co kdysi znali z první lekce
Rukou sklíčko z alkoholu nad plamenem suší
Je to zkrátka stádo volů co klid v duši ruší
A tak tedy sklíčko v ruce studentovi vzplálo
Trhnul sebou přímo prudce zděsil se ne málo
Zkrat a spousta lidí kolem měla na tom podíl
Do škatule s alkoholem on to sklíčko hodil
Krabice by během chvíle dohořela asi
Leč ty hlavy pošetilé začly si rvát vlasy
Do plamene hadry hází a ručníky taky
Kolem ohně spousta sazí a studentů mraky
Chtěl jsem proto do hašení vnésti trochu klidu
Šel jsem čelem ku plameni - zády zase k lidu
Jedna hadra jež se vzňala ze stolu však sklouzla
Za úkol si asi dala prováděti kouzla.
Hadra řádila jen s mírou - mohla řádit více
Přesto odnesla to dírou moje nohavice
Tyhle věci, ty se staly již před mnoha léty
Brzo mě pak jmenovali do požární čety!
Jednotlivé skupiny mikrobů
1. Priony (neobsahují nukleovou kyselinu, např. původce ,,nemoci šílených krav")
2. Viry (DNA a RNA, obalené a neobalené)
3. Bakterie (tyčinky, koky, spirochety; grampozitivní, gramnegativní)
4. Mikroskopické houby (kvasinky a plísně)
5. Paraziti (živočišné patogeny): vnější (členovci) a vnitřní (prvoci, oblovci, ploštěnci)
Ad 2: Viry dělíme na DNA-viry RNA-viry. Viry také můžeme dělit na obalené a
neobalené, případně podle počtu a typu vláken DNA, respektive RNA.
Ad 3: Bakterie dělíme například
* podle tvaru a uspořádání
o koky ­ kulovité, mohou tvořit dvojice, řetízky, shluky...
o tyčinky ­ protáhlé, mohou být rovné, zahnuté...
o kokotyčinky (kokobacily) ­ přechod mezi koky a tyčinkami
o spirochety ­ ve tvaru spirály
o bez tvaru ­ mykoplasmata nemají buněčnou stěnu, a tedy ani tvar
* podle Gramova barvení (je to dáno typem buněčné stěny)
o grampozitivní ­ barví se modře (tlustá, jednoduchá buněčná stěna)
o gramnegativní ­ barví se červeně (tenká, zato složitá buněčná stěna)
o Gramem se nebarvící ­ jiný typ stěny (mykobakteria) nebo stěnu nemají
(mykoplasmata), jsou příliš tenké a proto se nebarví (spirochety) apod.
* podle vztahu ke kyslíku
o striktně aerobní (rostou pouze v přítomnosti kyslíku)
o striktně anaerobní (vyžadují atmosféru bez kyslíku)
o fakultativně anaerobní (dokáží ,,přepínat metabolismus" a přízpůsobit se)
o aerotolerantní (metabolismus ,,nepřepínají", ale také se přizpůsobí, v praxi
neodlišitelné od přechozích)
o mikroaerofilní (potřebují kyslík, ale musí ho být málo)
o kapnofilní (potřebují kyslík, ale také zvýšený podíl CO2 v atmosféře)
o pro praxi se používá často jen dělení na aerobní (rostou za normální
atmosféry) a anaerobní (vyžadují atmosféru bez kyslíku)
ˇ podle patogenity:
o nepatogenní: nejsou schopni vyvolat nemoc (žádný jejich kmen není virulentní)
o potenciální (oportunističtí) patogeni jsou takové mikroby, které vyvolávají
chorobu jen někdy, jindy jsou "hodné". (E. coli ­ běžnou flórou ve střevě, ale
zároveň nejčastějším původcem močových infekcí)
o obligátní (primární) patogeni vyvolávají nemoc vždy, když se setkají
s makroogranismem (v dostatečném množství a vhodným způsobem)
PŘEHLED NEJDŮLEŽITĚJŠÍCH BAKTÉRIÍ (většina z nich se bude probírat v podzimním
semestru praktických cvičení):
Nejdůležitější grampozitivní koky:
Staphylococcus: S. aureus, ostatní jsou tzv. koaguláza-negativní stafylokoky
Streptococcus: hemolytické (betahemolytické) streptokoky (S. pyogenes, S.
agalactiae, takzvané ,,non-A-non-B" streptokoky), viridující (alfahemolytické)
streptokoky (S. pneumoniae = pneumokok a takzvané ,,ústní" streptokoky)
Enterococcus: E. faecalis, E. faecium
Nejdůležitětší grampozitivní tyčinky:
Listeria, Corynebacterium (nejen C. diphtheriae), Bacillus (ten je sporulující)
Nejdůležitější gramnegativní koky:
Neisseria (N. gonorrhoeae ­ gonokok, N. meningitidis ­ meningokok, ,,ústní" neiss.)
Branhamella catarrhalis ­ také Moraxella catarrhalis
Nejdůležitější gramnegativní tyčinky:
Enterobakterie: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus,
Providencia, Morganella, Serratia, Salmonella, Shigella, Yersinia
Gramnegativní nefermentující tyčinky: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter,
Burkholderia, Stenotrophomonas
Ostatní: Haemophilus, Pasteurella; Campylobacter, Helicobacter; Vibrio
Nejdůležitější anaeroby:
Clostridium (C. tetani, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens a jiná tzv. ,,klostridia
plynatých snětí)
Actinomyces ­ původce aktinomykózy (pozor, neplést s houbovou infekcí ­ mykózou)
Ostatní anaeroby většinou působí ve směsi. Jejich názvy nejsou zvlášť důležité
Nejdůležitěšjí spirochety:
Treponema (T. pallidum ­ původce syfilis), Borrelia, Leptospira
Nejdůležitější z ostatních bakterií:
Mycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae), Mycoplasma (M. pneumoniae, M. hominis),
Ureaplasma (U. urealyticum), rickettsie, chlamydie
Přehled mikrobiologických vyšetřovacích metod
Metody přímého a nepřímého průkazu mikrobů
Mikrobiologická diagnostika směřuje k odhalení původce nemoci a v některých případech také
ke zjištění (in vitro) citlivosti tohoto původce k antimikrobiálním látkám.
Skutečného původce je přitom často potřeba odlišit od
ˇ běžné flóry - tedy mikrobů, které se v některých tělních dutinách vyskytují normálně, od
* náhodného nálezu, který se např. do úst zatoulal s potravou, a také od
* kontaminace, tedy od mikrobů, které se do vzorku připletly omylem cestou.
Toto odlišení probíhá částečně v laboratoři a částečně na klinickém pracovišti.
In vitro citlivost se určuje u většiny baktérií a kvasinek, ne však u ostatních mikrobů. "In vitro"
citlivost (určená v laboratoři) ovšem o skutečné "in vivo" citlivosti u pacienta vypovídá jen
částečně. Je to dáno mimo jiné tím, že v laboratoři se mikroby chovají poněkud jinak než ve
tkáních.
Metody, kterými určujeme mikroby, si můžeme rozdělit na:
METODY PŘÍMÉ, pomocí kterých hledáme mikroba jako takového, jeho součást nebo jeho
produkt ve vzorku pacienta; vzorkem v takovém případě bývá např. moč, stolice, hnis,
mozkomíšní mok, výtěry z nejrůznějších tělních povrchů a otvorů.
Metody přímé si můžeme dále rozdělit:
A. Pokud hledáme mikroba bezprostředně ve vzorku, používá se zpravidla pojem přímý
průkaz. Je potřeba vzít v úvahu, že vzorek zpravidla obsahuje buňky makroorganismu a
že předem nevíme, kolik různých druhů mikrobů je ve vzorku obsaženo (pokud nějaké)
B. Kvůli nevýhodám přímého vyšetřování vzorku často potřebujeme získat kmen. Kmen
získáme kultivací mikroba na pevné půdě. Práce s kmenem mikrobiologům nahrazuje
práci s jedincem, tak jak ji znají zoologové či botanici. Pokud máme k dispozici kmen a
určujeme jeho vlastnosti, hovoříme o identifikaci mikroba. Některé metody identifikace
jsou tytéž, které se používají i k přímému průkazu (například lze mikroskopovat vzorek přímý
průkaz ­ i kmen ­ identifikace)
METODY NEPŘÍMÉ, kterými hledáme protilátky. Rozdíl je v tom, že protilátka není součástí ani
produktem mikroba - je produktem makroogranismu, i když by bez podráždění daným
mikrobem (resp. jeho antigenem) nevznikla. Nevýhodou nepřímých metod je, že nejsou
důkazem toho, že je mikrob v těle právě přítomen ­ svědčí jen o tom, že se s ním tělo někdy
setkalo (anebo se setkalo s očkovací látkou, která obsahovala části těla toho mikroba).
Hlavní rozdíly mezi přímými a nepřímými metodami
Metody přímé Metody nepřímé
Prokazujeme: mikroba, jeho součást nebo jeho
produkt
Prokazujeme: protilátky
Vzorek: všechno možné, vždy to, kde by mohl
být patogen
Vzorek: téměř vždy sérum
Pozitivní nález (zpravidla) znamená, že mikrob
je přítomen v těle
Pozitivní nález znamená, že tělo se (někdy
v historii) setkalo s mikrobem
Přehled přímých metod
Název metody K přímému průkazu ve vzorku K identifikaci kmene mikroba
Mikroskopie) Ano ano
Kultivace (pěstování na
půdách)
Ano ano
Biochemické a podobné
identifikační metody
Ne ano
Pokus na zvířeti Ano lze použít, ale nedělá se to
Průkaz antigenu/antigenní
analýza
Ano ano
Průkaz nukleové kyseliny Ano lze použít, ale nedělá se to
J01 + J02 ­ Mikroskopie
Nativní preparát
Nejjednodušší druh mikroskopie: mikroby se pozorují neobarvené, jen rozmíchané v kapce
fyziologického roztoku a přikryté krycím sklíčkem. Nepoužívá se imerze. Nativní preparát se hodí
a) na mikroby (baktérie, prvoky), kteří se pohybují
b) na velké mikroby - především tedy parazity a houby
Mikroskopie v zástinu
Je to zvláštní druh nativního preparátu. V důsledku jiného směrování paprsků je výsledkem světlý
objekt na tmavém pozadí. Používá se především u spirochet.
Barvené preparáty
Preparáty, které mají být nějak obarvené, musí být nejprve vysušeny a poté zfixovány - obvykle
protažením plamenem. Poté proběhne vlastní barvení. Preparát se vysuší (např. filtračním
papírem) a pozoruje se tzv. imerzním objektivem bez krycího sklíčka; mezi objektiv a preparát se
kápne kapka imerzního oleje.
* Jednoduché barvení - používá se například metylénová modř. Dá se provádět i přímo
v klinickém pracovišti jako nouzové orientační vyšetření.
* Mikrobiologové provádějí většinou Gramovo barvení. Je to nejdůležitější barvení
v mikrobiologii. Rozliší baktérie podle typu buěčné stěny na grampozitivní, gramnegativní a
gramem se nebarvící. Má čtyři kroky, po každém z nich se preparát oplachuje vodovodní
vodou. Po posledním oplachu se vysuší.
Chemikálie Čas Co se stane s grampozitivními Co se stane s gramnegativními
Violeť* 30 s Nabarví se na modrofialovo Nabarví se na modrofialovo
Lugolův roztok 30 s Viditelně nic, ale vazba se posílí Skoro nic
Alkohol 15 s Nic Odbarví se
Safranin 60 s Skoro nic, trochu změní odstín Nabarví se na červeno
*genciánová violeť, krystalová violeť, Gram I
* Různá speciální barvení se používají např. na tuberkulózu, na plísně, některé parazity apod.
* Ke speciálním účelům se používá fluorescenční barvení.
Interpretace mikroskopie. Použijeme-li mikroskopii jako přímý průkaz, nevidíme jenom mikroby
samotné, ale také různé jiné věci, například epitelie a leukocyty makroogranismu. Jejich
přítomnost a vzájemný poměr má velký význam při hodnocení nálezu. Například velké množství
neutrofilů svědčí o bakteriální hnisavý zánět.
Množství jednotlivých elementů (baktérií, epitelií, leukocytů apod.) se hodnotí zpravidla
semikvantitativně na jeden až tři (nebo čtyři) křížky.
Samozřejmě, je-li mikroskopie použita k identifikaci, vidíme už jednom příslušného mikroba.
Elektronová mikroskopie se používá u virů, ale nehodí se k rutinní diagnostice, spíše k výzkumu.
J03 ­ Kultivace
Kultivaci u virů se říká izolace.
Kultivace je pěstování mikrobů, zpravidla na umělých půdách. Mikroskopie je sice nejklasičtější
mikrobiologickou metodou, avšak kultivace je zdaleka nejdůležitější (alespoň v případě bakterií
a kvasinkovitých hub). Její význam spočívá především v tom, že umožňuje ze vzorku
(obsahujícího často směs mikrobů a téměř vždy buňky pacienta) izolovaný čistý kmen ve formě
tzv. kolonií. To ovšem platí jen pro tzv. pevné půdy. Důležité jsou ale i půdy tekuté, sloužící
zejména k pomnožení mikrobů tam, kde jich bylo získáno málo.
KMEN je populace mikrobů, vzešlá z jedné buňky, bez ohledu na formu. Všichni jedinci v rámci
kmene mají stejné vlastnosti.
KOLONIE je označení konkrétního útvaru, který bakterie a kvasinky vytvářejí při kultivaci na
pevných půdách. U většiny mikrobů vyroste za den. Pokud odtud mikroba přemístíme, přestává
být kolonií, zůstává však kmenem.
KULTIVAČNÍ PODMÍNKY zahrnují teplotu, vlhkost, složení atmosféry a podobně. Zpravidla se
laboratoř snaží vytvořit mikrobům podmínky blízké těm, které jsou v organismu. To znamená pro
každý z použítých fyzikálních a chemických faktorů dosáhnout hodnoty ležící v okolí optima,
resp. mezi dolní a horní inhibiční mezí:
ROZDĚLENÍ KULTIVAČNÍCH PŮD PODLE TYPU
Tekuté půdy (pomnožovací). Nejdůležitější je:
* Peptonová voda - obsahuje bílkovinný hydrolyzát (to jest: produkt rozkladu bílkoviny na
aminokyseliny a polypeptidy). Samotná se používá zřídka, je však mezistupněm k další:
* Bujón (masopeptonový bujón) je peptonová voda s vývarem. Je to základní
pomnožovací půda, běžně používaná v laboratoři hlavně tam, kde předpokládáme
malé množství mikrobů, jež chceme namnožit.
* VL-bujón je bujón s přídavkem kvasnic (francouzsky viande-levure = maso-kvasnice).
Hodí se pro anaeroby. Aby se mikroby při kultivaci nedostaly do styku se vzdušným
kyslíkem, přelévá se VL-bujón při kultivaci vrstvou parafinového oleje.
* Selenitový bujón je příkladem půdy selektivně pomnožovací. Taková pomnoží jen
některé mikroby ­ v případě selenitového bujónu salmonely (a několik dalších rodů).
Pevné (většinou agarové) půdy. Jsou to půdy, jejichž základem je zpravidla živný agar - to je
bujón, do kterého je přidán výtažek agarové řasy. Tím se stane, že z tekutiny se stane hmota
připomínající puding nebo želatinu. Fyzikálně vzato je to ovšem pořád tekutina: jakákoli
chemická látka, kterou umístíme na povrch agarové půdy, začne touto půdou poměrně
rychle pronikat (difundovat).
Na agarových půdách je báječná jedna věc: baktérie (a také kvasinky) na nich tvoří kopečky,
kterým říkáme kolonie. Každý druh bakterie tvoří na konkrétní půdě specifické kolonie
charakteristické velikosti, barvy, tvaru apod., což velmi usnadňuje diagnostiku.
Jedna kolonie zpravidla vyrůstá z jedné baktérie (nanejvýš z jedné dvojice, jednoho řetízku,
jednoho shluku - používá se tu anglický termín CFU = colony forming unit = jednotka tvoříci
kolonii). Z toho také logicky vyplývá, že pokud na agarovou půdu naočkujeme směs dvou
baktérií, a pokud tato směs není příliš hustá, vytvoří každý z těchto druhů své vlastní
charakteristické kolonie. Ty pak můžeme přeočkovat (= odebrat a nechat znovu kultivovat) a
různými metodami identigikovat.
Živný agar se v praxi nepoužívá. Když už se totiž v laboratoři vaří agarová půda, vždycky se do ní
něco přidává, co usnadňuje rozpoznání jednotlivých druhů.
U kolonií se dají popisovat různé znaky ­ velikost, barva, tvar, zápach a podobně.
Pevné půdy rozlišujeme podle účelu.
Diagnostické půdy jsou takové, na kterých "roste kdeco, ale každé jinak". Jinak řečeno - určitá
vlastnost baktérie se projeví na vzhledu kolonie. Do této skupiny patří i půda, která je mezi
klinickomikrobiologickými půdami úplně nejdůležitější:
Krevní agar je živný agar s přídavkem ovčích červených krvinek. Využívá se toho, že
patogenní druhy bakterií většinou rozkládají červené krvinky (úplná nebo neúplná betahemolýza)
nebo aspoň mění červený hemoglobin na zelené barvivo (viridace, někdy také
alfa-hemolýza). Méně patogenní druhy krvinky nemění (žádná hemolýza, také "gamahemolýza").
Krevní agar lze považovat i za půdu obohacenou (viz dále) ­ logika tohoto
zařazení spočívá v tom, že některé bakterie, např. streptokoky, by nerostly na živném
agaru, ale na krevním agaru vyrostou.
VL-agar (VL-krevní agar) je pozměněný krevní agar pro anaerobní bakterie.
Selektivní půdy jsou takové, na kterých "roste jenom něco". (Podobně jako u tekutých, selektivně
pomnožovacích půd). Patří sem např.:
Krevní agar s 10 % NaCl - je selektivní pro stafylokoky. Ostatní klinicky významné baktérie tak
vysokou koncentraci NaCl nesnášejí. Je to logické ­ stafylokoky žijí na (zpocené) kůži.
Selektivně diagnostické půdy v sobě spojují vlastnosti obou předchozích. Jinak řečeno, jedny
baktérie na nich nerostou, druhé baktérie rostou v určitých koloniích další zase v koloniích jiného
vzhledu.
Endova půda má svoji selektivní vlastnost. Ta spočívá v tom, že na ní rostou pouze
gramnegativní (G-) baktérie. Má ale také diagnostickou vlastnost. Baktérie, které štěpí
laktózu, na ní mají tmavočervené kolonie a tmavočervená je i půda v okolí koloníií. Laktózu
neštěpící baktérie tvoří kolonie bledé. Příčinou je indikátor ­ Schiffovo činidlo
Půdy XLD a MAL se pouzžívají k diagnostice salmonel.
Obohacené půdy jsou bohaté na živiny. Jsou určeny k pěstování náročných baktérií, které hned
tak na něčem nevyrostou - například hemofily nebo původce kapavky.
Čokoládový agar je vlastně krevní agar zahřátý asi na 80 °C. Přestože se do něj oproti
krevnímu agaru nic nepřídává, je obohacený tím, že různé látky z krvinek v něm volně
plavou a jsou tedy pro baktérie mnohem lépe dostupné.
Levinthalův agar je přefiltrovaný čokoládový agar. Je téměř bezbarvý, přesto je funkčně
hodně podobný předchozímu.
Speciální půdy mají své zvláštní určení.
Müllerův-Hintonové agar je určen k testování citlivosti baktérií in vitro na antibiotika.
Jak se kultivuje na pevných půdách
1. Na povrch půdy naneseme část vzorku nebo několik kolonií z předchozí kultivace.
2. Bakteriologickou kličkou toto místo "roztaháme" (rozředíme) po celé misce.
3. Nyní misku umístíme do termostatu, většinou při 37 °C. Většinou kultivujeme 16 - 28 hodin
(tedy do druhého dne), někdy ale déle (dva, tři i více dní). Po vyjmutí vidíme na misce
kolonie, které můžeme popisovat nebo s nimi provádět další identifikační pokusy.
J04 ­ biochemické identifikační metody
Tyto metody jsou založeny na skutečnosti, že každý druh baktérie produkuje jinou sestavu
enzymů. A tak třeba máme baktérii, která třeba umí rozštěpit (pomocí příslušných enzymů)
maltózu a sacharózu, ale ne trehalózu, a jinou, která umí štěpit sacharózu a trehalózu, ale ne
maltózu. Kombinace vhodného počtu znaků může určit baktérii nejen na úroveň rodu, ale
často i druhu.
PRINCIP těchto reakcí je takový, že bakteriím je předložen substrát (substráty). Pokud bakterie
produkují enzym(y), dojde k přeměně substrátu (substrátů) na produkt (produkty). V případě, že
se produkt(y) liší od substrátu(-ů) barvou, skupenstvím apod., můžeme změnu přímo pozorovat.
Pokud změna není viditelná, musí být v reakci přítomen indikátor. Nelze-li indikátor mít v reakci
od začátku, přidává se až po proběhlé reakci ve formě činidla.
Katalázová reakce je velmi jednoduchá biochemická reakce, založená na průkazu enzymu
katalázy (štěpí peroxid vodíku). Používá se k rozlišování rodů baktérií, např. stafylokoky jsou
kataláza pozitivní, streptokoky kataláza negativní. Provedení: kolonie bakterie je smíchána
s kapkou peroxidu vodíku. V případě pozitivity kapka šumí - vznikají bublinky kyslíku. Výhodou je,
že výsledek je viditelný během několika vteřin. Indikátor není třeba (bublinky jsou viditelné).
Reakce na diagnostických proužcích (stripech). Tyto reakce se také dají odečíst velmi rychle během
vteřin či nejpozději minut. Používá se plastových diagnostických proužků, jejichž reakční
ploška se zvlhčí a přitiskne na kolonie testované bakterie. Po určité době (a někdy ještě po
přikápnutí činidla) se pak sleduje, jestli na reakční plošce dojde k vývoji typického zbarvení
(např. modrého, modrozeleného, červeného).
Testy ve zkumavkách. Jednoduché testy obsahují substrát (např. cukr) a indikátor. Do substrátu
se vmíchá suspenze bakterie a inkubuje se přes noc. Když je reakce pozitivní, dojde k barevné
změně; když je negativní, ke změně nedojde. Složité testy využívají vícesubstrátových směsí.
Barevná změna pak může být např. jiná u hladiny (prstenec určité barvy) a jiná v hloubce.
Testy v plastové mikrotitrační destičce (,,panelu")
V podstatě jde o sérii miniaturizovaných jednoduchých zkumavkových testů. Bez ohledu na
konkrétní podobu jednotlivých destičkových testů (liší se podle výrobce, nové výrobky od
starších apod.) je princip prakticky vždy stejný: na dně důlků jsou lyofilizované substráty
(případně substráty s indikátorem), do důlků se přikápne suspenze baktérie a destička se
nechá inkubovat (obvykle přes noc). Poté se hodnotí, u kterých testů došlo ke změně barvy.
Hodnotí se to pouhým okem nebo automaticky - čtecím zařízením na principu
spektrofotometru. Hodnotí se zpravidla najednou 8 ­ 30 různých biochemických reakcí.
POKUS NA ZVÍŘETI
Pokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Šlo tehdy i o to,
prokázat, zda příslušný mikrob vůbec je původcem nemoci ­ naočkoval se tedy pokusnému
zvířeti a čekalo se, zda také u zvířete propuknou příznaky podobné těm u pacienta.
V některých případech se podobně postupuje dodnes. Nejčastěji se používají myši, morčata,
potkani, králíci. Význam pokusu na zvířeti klesá s rozvojem modernějších metod i s tím, jak si lidé
stále více uvědomují, jak je jeho využívání eticky problematické.
Zvířata (hl. hospodářská) se ovšem v mikrobiologické diagnostice uplatňují i jinak, např. jejich séra
jsou zdrojem protilátek, z jejich krvinek se připravují krevní agary (nejčastěji s ovčími, ale i např. s
hovězími či koňskými erytrocyty) apod.
PRŮKAZ ANTIGENU
Jedná se o metodu přímého průkazu, avšak způsob provedení je shodný s nepřímým průkazem
(průkazem protilátek) - v obou případech se hovoří o tzv. sérologických reakcích. Ty budou
proto probrány v další části diagnostiky.
Desinfekce a sterilisace ­ téma J05
Baktérie a vnější prostředí
Baktérie (a podobně i ostatní mikroby) jsou velmi citlivé na změny vnějšího prostředí. Na ose
(která již byla uvedena u kultivace) znázorňující kvantitu nějakého faktoru (třeba pH či teplotu),
můžeme určitou hodnotu definovat jako optimální. To je hodnota, při níž se baktériím daří
nejlépe. Když se hodnota zvyšuje nebo snižuje, narazíme nejprve na inhibiční mez, kdy je
inhibován (zastaven) růst bakérií, a nakonec na baktericidní mez, kdy jsou mikroby nevratně
ničeny (usmrceny). Faktorem, o němž je řeč, může být kromě teploty také třeba tlak, vlhkost,
koncentrace nějaké chemické látky apod. Pokud hovoříme o nějaké chemické látce, která
baktériím škodí (desinfekční činidlo, antibiotikum ­ viz dále), používají se pro výše uvedené meze
pojmy minimální inhibiční koncentrace a minimální baktericidní koncentrace.
Faktory se navzájem kombinují; přinejmenším se vždycky kombinují s časem. Proto vyšší teploty
ničí baktérie za kratší dobu, než teploty nižší. - Lékařsky významné baktérie jsou obvykle
nastaveny na podmínky, jaké mohou naleznout v lidském (nebo zvířecím) organismu: 37 °C,
0,9 % NaCl apod. Baktérie s optimem kolem 37 °C se nazývají mezofilní, ty, které mají optimum
vyšší, termofilní, pokud nižší, jsou psychrofilní.
Praktický význam těchto mezí:
1. Baktericidní meze jsou významné pro boj s mikroby (sterilisace, desinfekce) - hodnoty
působících faktorů musí být nastaveny tak, aby byly baktérie usmrceny.
2. Inhibiční meze a optimální hodnoty jsou důležité pro pěstování (kultivaci) baktérií. Je důležité
vědět, že různé baktérie se liší (často velmi podstatně) ve svých nárocích na teplotu, vlhkost,
koncentrace solí apod. Jednak je při kultivaci konkrétní baktérie důležité vytvořit jí vhodné
podmínky, jednak lze rozdílů mezi druhy a rody baktérií použít také při jejich určování (roste na
půdě s vysokou koncentrací soli? je to stafylokok; neroste tam? není to stafylokok). Inhibiční mez
u antimikrobiálních látek (minimální inhibiční koncentrace) je důležitá pro antimikrobiální léčbu.
Dekontaminační metody
jsou fyzikální a chemické postupy určené především k likvidaci zdraví ohrožujících organismů mikrobů
(sterilizace, vyšší stupeň desinfekce, desinfekce), hmyzu (desinsekce) a hlodavců
(deratizace). Některými metodami se ovšem zlikvidují všechny (mikro)organismy. Při použití
všech těchto metod je důležité dodržení několika zásad. Je nutno především:
* Vybrat vhodnou sterilizační/desinfekční metodu nebo prostředek. Pojem "vhodný"
znamená:
musí bezpečně ničit ty organismy, které připadají v daném prostředí v úvahu
nesmí ničit desinfikovaný či sterilizovaný materiál (povrch, pokožku...)
musí být prakticky použitelný (z ekonomických hledisek, provozních apod.)
* Použít dostatečnou intenzitu faktoru - dostatečnou teplotu, intenzitu záření, dostatečnou
koncentraci přípravku apod.
* Příslušný faktor musí působit dostatečně dlouho (často se nedodržuje - sestra potře kůži
desinfekcí a hned už píchá injekci!).
Protože koncentrace, teploty a působení jsou u každé metody a u každého prostředku jiné, je
vhodné mít po ruce dostatečně čerstvý přehled těchto čísel. Vhodná je např. knížka Desinfekce
a sterilizace, vydaná před časem nakladatelstvím Grada. Dobré je také mít k dispozici platnou
vyhlášku. Je potřeba zjistit, zda se metoda hodí pro účel, pro který ji chceme použít, jaké se
užívají hodnoty působícího faktoru (teploty, koncentrace) a jaký čas je předepsán pro jeho
působení (u desinfekce je někdy místo přesného časového údaje udáno ,,do zaschnutí" ­ to
ovšem znamená, že prostředek je skutečně nutno nechat zaschnout!). U desinfekce je velice
důležitý údaj o spektru účinku ­ např. A = bakterie a kvasinky, B = bakteriální spory, C = viry
apod. U sterilizace není údaj nutný, protože z principu sterilizace musí být vždy ničeno všechno.
STERILIZACE. Je to postup (obvykle fyzikální), kterým jsou zničeny všechny mikroby (včetně virů,
hub a bakteriálních spor). Nejčastěji se používá:
1. Sterilizace horkou parou pod tlakem (autoklávování). Pára musí být právě nasycená (to
znamená, že kdyby obsahovala jen nepatrně více vody, začala by se voda srážet).
Hodí se na předměty ze skla, kovu, keramiky, kameniny, porcelánu, textilu, gumy a
některých plastů. Teploty kolem 115 ­ 134 °C.
2. Sterilizace horkou vodou pod tlakem - pouze u chirurgických nástrojů k okamžitému
použití. Málo se používá také sterilizace horkým olejem.
3. Sterilizace horkým vzduchem (u přístrojů s nucenou cirkulací vzduchu 180 °C 20 minut
nebo 170 °C 30 minut nebo 160 °C hodinu). Hodí se na kovy, sklo, porcelán a kameninu.
4. Sterilizace ohněm se používá prakticky jen u mikrobiologických kliček, protože většinu
materiálů silně poškozuje. Spalování se hodí u opdadů.
5. Sterilizace gama zářením: používá se pouze při průmyslové výrobě, např. rukavic na
jedno použití.
6. Chemická sterilizace parami formaldehydu nebo ethylenoxidem (musí být přesně
dodržen postup). Používá se tam, kde nelze použít fyzikální metody.
7. Paskalizace je sterilizace tlakem v potravinářství
8. Odstatní metody: frakcionovaná sterilizace, filtrace roztoků aj. jsou speciální, používají se
výjimečně
VYŠŠÍ STUPEŇ DESINFEKCE je nový pojem, který znamená "něco mezi sterilizací a desinfekcí". Tento
postup na rozdíl od sterilizace nemusí zničit například cysty prvoků nebo vajíčka červů.
Používá se glutaraldehydu, Sekuseptu nebo Persterilu (vyhláškou je dáno, jaké koncentrace je
potřeba použít - vždy jsou vyšší než pro běžnou desinfekci). Vyšší stupeň desinfekce slouží
například k ošetřování flexibilních endoskopů s vláknovou optikou, popř. i jiných přístrojů, u
kterých nelze použít žádné metody sterilizace.
DESINFEKCE. Je to chemický nebo i fyzikální postup, kterým se ničí původci nemocí. Obvykle však
nejsou ničeny všechny mikroby. Dobrá desinfekce je taková, která ničí všechny PATOGENNÍ
mikroby, které se v daném prostředí vyskytují. Dobrá desinfekce tedy nemusí postihovat
původce tuberkulózy, pokud se v daném místě nevyskytuje. Stejně provedená desinfekce v
tuberkulózní léčebně by ovšem byla desinfekcí špatnou.
A. FYZIKÁLNÍ METODY
1. Var: a) za normálního tlaku - ve zdravotnictví alespoň 30 minut. V kuchyni i méně, ale
jídlo se musí provařit (i uvnitř!), b) v tlakových hrncích - zkrácení času - ani v tom případě
však nejde o sterilizaci!!!
2. Jiné fyzikální metody - filtrace, žíhání, slunění, UV záření apod.
B. DESINFEKČNÍ PROSTŘEDKY
Oxidační činidla
3. Výborné jsou peroxidy, zvláště kyselina peroctová (CH3COOOH, u nás Persteril). Působí i
na spory, houby, a tuberkulózu; 0,5 % roztok spadá pod pojem vyšší stupeň desinfekce.
Nevýhodou je agresivita na sliznice i materiály, např. kovy, odbarvování textilií a
nestabilita roztoků.
4. Peroxid vodíku (H2O2) - podobný, méně agresivní, také ale méně účinný.
5. Dobré jsou i halogenové preparáty. Z chlorových je to chlornan sodný (NaOCl), u nás
Savo s všestranným použitím. Také chlornany jsou bělidlem. Chlornan vápenatý
(Ca(OCl)2; chlorové vápno) se hodí k hrubé desinfekci velkých ploch. Dříve se sypal do
suchých záchodů, avšak hygienický přínos byl sporný a ekologický negativní.
6. Chloramin je prášek (Chloramin B; Chloraminy BM a BS jsou s přísadami).
7. Jodovou tinkturou se ošetřovaly drobných rány. Pak se zjistilo, že alergizuje a je
agresivní, dnes se ale ukazuje, že to zase není tak hrozné. Přesto lepší jsou prostředky
jako je Jodonal B a Jodisol, kde je jód vázán v komplexu. Jodonal B by měl dostat u
nealergických pacientů před Ajatinem při ošetřování chirurgických ran.
8. Manganistan draselný se již neužívá.
Alkoholy, fenoly a aldehydy
9. Formaldehyd se samotný používá spíše jako konverzační činidlo a k uchování
očkovacích látek. Často se však aldehydy (vedle formaldehydu především
glutaraldehyd) používají ve směsích, např. s tenzidy.
10. Kresol (lysol) je účinný, pro zápach a agresivitu se již téměř neužívá.
11. Ethylalkohol není příliš účinný; když už, tak nejúčinnější je asi 70 % vodný roztok,
koncentrovaný je neúčinný. Ani zapálením etanolu není dostatečně účinné a navíc
hrozí požárem.
Kvarterní amonné soli a tenzidy
12. Orthosan BF 12 k desinfekci např. povrchů - pozor, některé jiné Orthosany nejsou
desinfekční prostředky, např. Orthosan BF 40 je na vši!
13. Ajatin - běžný pro desinfekci pokožky. Není agresivní a nealergizuje. Jeho účinnost
nedosahuje parametrů oxidačních činidel.
14. Septonex se užívá na kůži, nejen jako desinficiens, ale také jako antiseptikum. Při
dlouhodobém používání je ale pravděpodobně karcinogenní.
Anorganické kyseliny a louhy - hrubá df. v zemědělství a průmyslu
Těžké kovy - zřídka, např. k ochraně budov před plísněmi - Lastanox
Kombinované přípravky
Např. Incidur, Spitaderm, Sterilium, jinak nemá smysl uvádět konkrétně, neboť se stále mění.
Nových desinfekčních rostředků se objevuje stále mnoho. Upoutávají moderními obaly a vůní,
ne všechny jsou ale účinné, někdy jde vlastně jen o tekuté mýdlo a ne o desinficiens. Je
vždycky potřeba zjistit konkrétní údaje o tom, k čemu se prostředek hodí, na které mikroby je
účinný, v jaké koncentraci se používá. V případě pochyb se lze obrátit o radu na nejbližší
hygienickou stanici.
Desinsekce a deratizace se někdy také řadí k dekontaminačním metodám.
Příprava před dekontaminací a uchovávání dekontaminovaných předmětů
Před dekontaminací. Chirurgické nástroje jsou často mechanicky znečištěny a musí se před
desinfekcí umýt. Pozot!!! Mytí = odplavení nečistot, kdežto desinfekce = usmrcení patogenů!
Mechanická očista obvykle předchází před desinfekcí. Výjimkou je desinfekce rukou kde je to
naopak (jinak by se infekční částice rozprašovaly proudem vody).
Po dekontaminaci. Při použití par (formaldehydových, persterilových...) je nutno předměty řádně
odvětrat. Je také nutno dbát na omezenou trvanlivost různých dekontaminačních postupů.
Napřík. v papírových sáčcích vydrží předměty sterilní 3 měsíce, je-li sáček uzavřen lepením,
avšak jen 4 týdny, je-li uzavřen pouze sešívačkou. To vše stanoví vyhláška.
Kontrola účinnosti dekontaminace
Orientačně - smyslově - např. pomocí charakteristického zápachu
Stanovení skutečné koncentrace desinfekčních prostředků (chemicky)
Chemická kontrola sterilizace využívá indikátorů, které při určité teplotě mění vlastnosti (např.
zbarvení). Způsob biologický užívá odolné kmeny Bacillus subtilis či B. stearothermophilus.
Mechanická očista (omývání)
nemůže nahradit desinfekci, ale také naopak desinfekce nemůže nahradit omytí. Mechanické
nečistoty brání prostupu desinfekčního prostředku či třeba par formaldehydu na správné místo,
proto je sterilizace či desinfekce bez omytí zbytečná. Viz též "Příprava před/po dekontaminaci".
Asepse a antisepse jsou pojmy, které souvisejí s pojmy jako desinfekce, sterilizace apod., ale
nesou v sobě jiný úhled pohledu. Nejde tu o to, který škodlivý organismus (všechny mikroby,
patogenní mikroby...) má být zničen, ale o to zda jde o pasivní či aktivní přístup.
ASEPSE vychází z toho, že dané prostředí je primárně sterilní či přinejmenším zbavené patogenů.
Aseptické postupy jsou tedy takové, které pasivně brání vniknutí infekce do takového prostředí.
Patří sem vše od stavebního uspořádání operačních traktů (odděleně od ostatního
nemocničního provozu) přes používání důsledně jednorázových nebo sterilizovaných nástrojů a
materiálů až po režimová opatření. Asepticky se ale musí pracovat nejen na oddělení u
pacienta, ale i v laboratoři při zpracování vzorků - cílem je nekontaminovat vzorek mikroby z
prostředí, což by znamenalo falešné (falešně pozitivní) výsledky
ANTISEPSE zahrnuje postupy, které aktivně zasahují proti infekci. Mohu sem patřit postupy
desinfekce a sterilizace, ale v podstatě i používání antiseptik, které jinak řadíme spíše mezi
používání antimikrobiálních látek než mezi dekontaminační postupy.
Antimikrobiální látky ­ téma J06
Přehled antimikrobiálních látek
Antibiotika - proti bakteriím, produkty baktérií nebo hub
Antibakteriální chemoterapeutika - proti bakteriím, syntetická
Antituberkulotika - proti bacilům tuberkulózy (ty se hodně liší od jiných bakterií)
Antivirotika - proti virům
Antimykotika - proti houbám
Antiparazitární látky - proti parazitům
Antiseptika - k lokální léčbě různých infekcí
ˇ LÁTKY (primárně) BAKTERICIDNÍ - při běžně používaných koncentracích mikroby zabíjejí.
Používají se i u těžkých stavů
* LÁTKY (primárně) BAKTERIOSTATICKÉ - při běžně používaných koncentracích inhibují růst,
zbylé mikroby pak postupně hynou
Přehled antimikrobiálních látek
* PENICILINY působí na buněčnou stěnu bakterií, jsou baktericidní (bakterie zabíjejí),
dobře se kombinují s aminoglykosidy, nesmějí se kombinovat s makrolidy, tetracykliny,
chloramfenikolem a linkosamidy (navzájem snižují svůj účinek). Nejsou téměř toxické,
ale mohou vyvolávat alergie. Toto vše platí i pro cefalosporiny a nové penemy.
Klasické: penicilin - účinný například na angíny
Protistafylokokové: oxacilin - pouze na stafylokoky
Širokospekteré - působí i na gramnegativní tyčinky. Nejstarší z nich je ampicilin.
Podobný je také amoxycilin(AMOCLEN, DUOMOX).
Kombinace s inhibitorem betalaktamáz ­ viz dále, např. kyselina klavulanová
v kombinaci s amoxycilinem (AUGMENTIN, AMOKSIKLAV).
Protipseudomonádové např. tikarcilin
* CEFALOSPORINY jsou účinné proti G+ kokům (hlavně první generace) a G- tyčinkám
(hlavně třetí generace)
I. generace: cefalotin (injekční), cefalexin (CEFACLEN - tabletový)
II. generace: nejznámější cefuroxim axetil (ZINNAT, ZINACEF)
III. generace: například ceftriaxon (ROCEPHIN, LENDACIN), cefoperazon (CEFOBID);
III. generace s inhibitorem betalaktamáz: cefoperazon se sulbaktamem, (působí
obdobně jako kyselina klavulanová - SULPERAZON)
IV. generace: např. cefepim (MAXIPIME)
cefamyciny - příbuzné cefalosporinům: cefoxitin (MEFOXIN)
* NOVÉ BETALAKTAMY mají velice široké spektrum a používají se jako rezervní, když už nic
nepomáhá (zejména karbapenemy)
monobaktamy, např. aztreonam
karbapenemy, např. imipenem (TIENAM)
* AMINOGLYKOSIDY jsou baktericidní. Nevýhodou je, že jsou jedovaté pro sluch a ledviny.
Některé se pro jedovatost užívají jen lokálně (neomycin - tvoří spolu s bacitracinem
FRAMYKOIN). Patří sem např. gentamicin, a amikacin. Hodí se hlavně na G- mikroby.
* TETRACYKLINY jsou pouze bakteriostatické. (Totéž platí i o dalších třech skupinách.) Jsou
jedovaté pro játra a vyvolávají nevolnost. Nesmějí se kombinovat s alkoholem a s
mlékem (vápník), ale ani s preparáty Mg, Fe a Zn. Nepodávají se u dětí do osmi let (kvůli
vývojí kostí a zubů), těhotných a kojících. Dnes se používají méně, ale na některé
mikroby jsou pořád nejlpepší. Používá se tetracyklin, či doxycyklin
* CHLORAMFENIKOL je jedovatý pro krvetvorbu, ale má dobrý průnik do mozkomíšního
moku.
* MAKROLIDY jsou účinné prakticky jen na G+ bakterie (azithromycin i na hemofily).
Nevolnost při užívání I. generace se u II. generace snížila. Používají se mj. při alergii na
peniciliny.
I. generace: erytromycin
II. generace: clarithromycin (KLACID), roxithromycin (RULID), azithromycin
(SUMAMED) /stačí znát jeden z nich/
* LINKOSAMIDY jsou rezervní antibiotika. Používají se jen v nemocnici při infekcích kostí a
měkkých tkání. Patří sem např. linkomycin
* CHINOLONY jsou vlastně chemoterapeutika, nikoli antibiotika. I. a II. generace se hodí
jen pro močové infekce (v moči se koncentrují, ve tkáních málo). Od II. generace se
nesmějí podávat dětem do 15 let (mají asi vliv na chrupavku).
I. generace - kyselina oxolinová (DESUROL)
II. generace - norfloxacin (NOLICIN, GYRABLOCK)
III. generace - ciprofloxacin (CIPROBAY, CIPRINOL), ofloxacin (TARIVID, OFLOXIN)
* OSTATNÍ ANTIBIOTIKA A CHEMOTERAPEUTIKA
Sulfonamidy mají omezené použití. Používá se hlavně sulfametoxazol kombinovaný s
jiným chemoterapeutikem trimetoprimem jako kotrimoxazol (SEPTRIN, BISEPTOL). Při
léčbě ve stravě zákaz konzumace kyselin (citron) - nebezpečí krystalizace v
ledvinách.
Nitrofurantoin se používá pouze k léčbě močových infekcí. Barví moč na žluto
(upozornit pacienta!)
Rifampicin se používá pouze v kombinaci. Dnes zůstává jako rezervní a k léčbě
tuberkulózy
Vankomycin a teikoplanin jsou rezervní antibiotika na G+ mikroby. Jsou značně
toxické (ucho, ledviny, krev)
Polymyxiny (polymyxin B a colistin) jsou značně jedovaté - ten první tak moc, že se
používá pouze lokálně (v ORL). Druhý se používá zejména na rezistentní G- tyčinky.
* ANTITUBERKULOTIKA jsou např. izoniazid nebo etambutol. Vždy se používá kombinace tří
nebo čtyř látek, dlouhodobá léčba
* ANTIMYKOTIKA
Imidazolová a triazolová: flukonazol (DIFLUCAN), ketokonazol (NIZORAL) k
celkovému, popř. i lokálnímu podání; kotrimazol (CANESTEN) pouze k lokálnímu
podání. Navzájem se značně liší v účinnosti na různé houby
Polyenová: amfotericin B - vysoce toxický, pro těžké mykózy - k celkovému podání;
nystatin (FUNGICIDIN) - k lokálnímu podání
Analoga pyrimidinů (látky příbuzné některým cytostatikům flucytosin (ANCOTIL) nutno
vždy v kombinaci!!, i u dětí.
* ANTIVIROTIKA
proti herpesvirům: např. acyklovir (ZOVIRAX, HERPESIN)
proti chřipce: např. amantadin
proti HIV: např. zidovudin, další jsou nyní ve vývoji - na vývoji nadějných preparátů se
podílí mj. český vědec dr. Holý
* ANTIPARAZITÁRNÍ LÁTKY
proti prvokům: nitroimidazoly - např. metronidazol (AVRAZOR); chinin a chlorochin
(na malárii) a spousta dalších
proti plochým červům: např. niklosamid
proti oblým červům: např. pyrvinium
* ANTISEPTIKA A LOKÁLNÍ ANTIBIOTIKA. Vedle již zmíněného bacitracinu s neomycinem
(FRAMYKOIN) se používá mupirocin (BACTROBAN), různé formy SEPTONEXu, ale také
spousta dalších látek, používaných jako desinficiencia: JODONAL B, JODISOL. PERSTERIL,
peroxid vodíku, nebo chlorhexidin.
(Poznámka: Názvy látek jsou uváděny jako generické, tedy název účinné látky, a případně FIREMNÍ - název konkrétního preparátu; z
firemních názvů jsou vybrány jen ty nejběžnější - například kotrimoxazol je dnes u nás registrován pod čtrnácti názvy!)
Mechanismus účinku, vylučování, toxicita ­ přehled
Peniciliny
Cefalosporiny
Nové b-laktamy
Toxicita:
nepatrná, zato
mohou
vyvolávat
alergie
Působí na:
buněčnou stěnu Vankomycin
Aminoglykosidy
baktericidní vylučování
převážně močí
(u jednotlivých
se může lišit)
značná - ušní,
močová, popř.
nervová
Tetracykliny bakteriostatické vylučování
převážně žlučí
játra,
trávení; !zuby!
Makrolidy malá
(játra, trávení)
Linkosamidy malá
(trávicí obtíže)
syntézu proteinů
Chloramfenikol !!krvetvorba,
tráv., nerv.
nukleové
kyseliny
Chinolony malá,
tráv., CNS. !věk!
cytop.
membránu
Polymyxiny
baktericidní
velká:
nervy, moč. syst.
metabolismus Sulfonamidy bakteriostatické
vylučování
převážně
ledvinami
ledviny, GIT a
jiné
Pojem MIC
U antimikrobiálních látek platí totéž, co u jiných chemických látek (a podobně i v případě
fyzikálních charakteristik): pokud zvyšujeme koncentraci, dosáhneme hodnoty MIC - minimální
inhibiční koncentrace. Jedná se o koncentraci, při které se bakterie přestanou množit. Jinak
řečeno, je to bakteriostatická koncentrace (resp. fungistatická, virustatická).
Pokud koncentraci zvyšujeme dále, dostaneme se na hodnotu MBC - minimální baktericidní
koncentrace. Při této koncentraci jsou baktérie (či analogicky jiné mikroby) usmrceny.
U primárně baktericidních antibiotik je MIC a MBC prakticky totožná, tj. téměř se nestává, že by
baktérie nerostly, ale přitom nebyly usmrceny. Nopak u primárně bakteriostatických antibiotik je
MBC velmi vysoká, mnohem vyšší než MIC. Pro praxi tedy u těchto antibiotik používáme
koncentrací, které jsou jen bakteriostatické. Nevadí to, protože se zbylými mikroby si poradí
organismus pacienta. Nesmí ale jít o těžký stav, poruchu imunity apod. ­ tam je nutno vždy
používat antibiotika primárně baktericidní.
Při praktickém používání antibiotik je známo, že při určitém běžném dávkování se u pacienta
vytvoří určitá koncentrace antibiotika. Jde o to, jestli tato koncentrace je alespoň inhibiřční.
Musíme tedy znát koncentraci antibiotika, které je při běžném dávkování dosaženo v krvi a ve
tkáních (s určitou rezervou a zahrnutím individuálních rozdílů) ­ breakpoint. S ním porovnáváme
zjištěnou hodnotu MIC. Pokud je breakpoint vyšší než MIC, plyne z toho, že breakpointová
koncentrace je inhibiční a antibiotikum lze použít. Pokud je koncentrace dosahovaná v krvi nižší
než MIC, říkáme, že antibiotikum je na danou látku rezistentní - dosahovaná koncentrace není
inhiibiční. Je-li rozdíl jen malý, dá se problém vyřešit zvýšeným dávkováním; je-li větší, je nutno
použít jiné antibiotikum.
Koncentrace dosahovaná v krvi je ovšem určující jen pro některé infekce. U opouzdřených
procesů (abscesů) nebo třeba meningitid je nutno počítat s tím, že do místa infekce pronikne
méně antibiotika, než do krve. U močových infekcí nemá vůbec smysl brát v úvahu koncentraci
antibiotika v krvi - místo toho se MIC porovnává s koncentrací antibiotika v moči.
Problémem také je, že mnohé bakterie žijí na sliznicích ve formě biofilmu. K rozbití biofilmu
zpravidla nestačí MIC. Používá se pojem MBIC ­ minimální biofilm inhibující koncentrace a
pojem MBEC ­ minimální biofilm eradikující koncentrace. V praxi se však MBEC a MBIC (alespoň
zatím) nestanovuje, vzhledem k extrémní pracnosti a náročnosti metod, kterými by se to dalo
provádět.
Typy rezistencí na antibiotika a jejich mechanismy
Primární a sekundární rezistence
Primární (konstituční) rezistence je společná vždy všem kmenům daného druhu. Je zpravidla
dána tím, že stavba mikroorganismu vylučuje, aby na něj dané antibiotikum působilo. Například
betalaktamová antibiotika, působící na buněčnou stěnu, nelze použít k léčbě infekcí
působených mykoplasmaty, protože ta žádnou buněčnou stěnu nemají. Některá antibiotika
účinkují jen na grampozitivní nebo naopak jen na gramnegativní bakterie apod.
Sekundární (získaná) rezistence se vyskytuje jen u některých kmenů. Z toho také plyne, že není
předvídatelná a musíme ji zjišťovat u každého kmene zvlášť. Sekundární rezistence je umožněna
mutacemi na bakteriálním chromosomu nebo plasmidu. Za normálních okolností by se mutace
neuplatnila. Pokud ale používáme určité antibiotikum, stane se ,,umění být necitlivá" pro
bakterii výhodnou a taková bakterie logicky vyhrává v soutěži s ostatními. Nadměrným a
zejména nesprávným používáním antibiotik tedy zvýhodňujeme (selektujeme) rezistentní kmeny
bakterií. Proto je tak důležité používat antibiotika s rozvahou.
Příklady mechanismů rezistence
Znehodnocení antibiotika ještě než vnikne do buňky (rozštěpení důležité části molekuly, navázání
bočního řetězce, který mění antibiotikum v neúčinný metabolit, apod.)
Nevpuštění antibiotika do buňky, například změnou cytoplasmatické membrány
Změnou cílového místa pro působení antibiotika
Betalaktamázy a jejich inhibitory
Asi nejznámnějším i nejvýznamnějším příkladem faktoru rezistence jsou různé typy betalaktamáz jsou
to enzymy, které produkují nejrůznější typy baktérií. Betalaktamázy štěpí betalaktamový
kruh penicilinových, cefalosporinových a ostatních betalaktamových antibiotik ­ většinou ale
jen některých z nich.
Pro překonání některých typů betalaktamáz se používají takzvané inhibitory betalaktamázy.
Inhibitor betalaktamázy je ,,falešné antibiotikum" ­ málo účinná betalaktamová látka, která je
však silně atraktivní pro betalaktamázy. Betalaktamáza se vysytí tím, že rozštěpí betalaktamový
kruh inhibitoru, zatímco skutečné účinné antibiotikum zůstává nepoškozené a může působit.
Nejběžnějšími kombinacemi antibiotika + inhibitoru betalaktamázy jsou amoxicilin + kyselina
klavulanová, ampicilin + sulbaktam, tikarcilin + kyselina klavulanová, cefoperazon + sulbaktam.
Některé významné typy polyrezistentních kmenů, způsobující často nemocniční infekce
MRSA ­ methicilin rezistentní stafylokoky. Kvůli změně cytoplasmatické membrány nevpouštějí
tyto bakterie do svých buněk oxacilin (či methicilin, používaný v některých zemích tak jako
oxacilin u nás). Oxacilin je přitom klasické protistafylokokové antibiotikum. Mnohé MRSA jsou
rezistetní také na další antibiotika (makrolidy, linkosamidy) a pak už k léčbě zůstávají prakticky
jen velmi drahé a toxické glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin). Ve světě se bohužel objevily i
stafylokoky částečně nebo úplně rezistentní na glykopeptidy (VISA, VRSA).
VRE ­ vankomycin rezistentní enterokoky. Kmeny enterokoků, které jsou necitlivé na glykopeptidy
a zpravidla nejsou citlivé ani na většinu ostatních antibiotik. Léčba je obtížná či nemožná.
Producenti ESBL ­ gramnegativní bakterie (enterobakterie a gramnegativní nefermentující
bakterie), které produkují takzvané širokospektré betalaktamázy. Ani účinek inhibitorů na ně
není dostatečný. I v tomto případě zůstává jen velmi omezená škála účinných léčiv. Navíc tyto
kmeny často v rámci nemocničních infekcí postihují oslabené jedince, kteří mnohá antibiotika
nemohou dostávat vzhledem ke své základní chorobě.
Má-li dívka absces kůže
či dokonce prsa
Oxacilin nepomůže
je-li vinen MRSA
Ten kdo si ho pustí k tělu
anebo i jiné
/: kupříkladu klebsielu
toho léčba mine
Tvoří si ty klebsiely
betalaktamázy
Na arzenál farmak celý
drze bobky hází
My se jich však nebojíme
z nemocnic je ženem
/: co na ně - to přece víme
čistota a penem! :/
Přesto jsou i těžké chvilky
kdy si stýská klinik
Pište recept na lentilky
navrhuje cynik
I když to dá mnoho práce
naději však máme
/: léky nové generace
zas je přečůráme :/
Zjišťování citlivosti na antimikrobiální látky in vitro
Metody zjišťování citlivosti
Zjišťovat citlivost in vitro je vhodné u většiny nálezů patogenních bakterií, pokud se dají kultivovat.
Je sice třeba brát v úvahu, že laboratorní výsledky nemusí z různých důvodů stoprocentně
souhlasit s výsledky u pacienta, ale přesto je testování in vitro zpravidla mnohem lepší, než
nedělat nic.
Nejběžněji se používá difusní diskový test, který se snadno provádí, ale je pouze kvalitativní a
nehodí se pro kmeny od závažných pacientů. U těch se používají kvantitativní testy ­ E-test
anebo mikrodiluční test.
Difúzní diskový test
Na Müller-Hintonův agar (nebo jiný agar) se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie. Pak se
nanášejí tzv. antibiotické disky ­ papírky napuštěné antibiotikem. Pokud mikrob roste až k disku,
je rezistentní (necitlivý). Pokud je kolem disku zóna citlivosti, v níž mikrob neroste, a je větší než
předepsaná, je citlivý.
V principu jde o to, že antibiotikum difunduje (prostupuje) z disku agarem dál, přičemž jeho
koncentrace klesá. Každé vzdálenosti od disku by bylo možno přiřadit určitou koncentraci.
"Předepsaná zóna" je vlastně taková, kde koncentrace odpovídá danému breakpointu, tj.
koncentraci antibiotika v krvi (viz výše).
(Pro jednoduchost zde mluvíme jen o baktériích; u kvasinek se tento test dělá zřídka, u ostatních
mikrobů vůbec.)
E-testy
Jsou to podobné testy, ale místo disku se použije proužek se stoupající koncentrací antibiotika od
jednoho konce proužku ke druhému. Antibiotikum opět difunduje, ale zóna tu není kruhová, ale
vejčitá. Na rozdíl od předchozího testu se E-testem dá určit MIC (minimální inhibiční
koncentrace - tedy nejnižší koncentrace, která zastavuje růst mikroba). Odečítání je
jednoduché - na papírku je stupnice, a MIC se odečítá v místě, kde okraj zóny kříží papírek.
Mikrodiluční test
Antibiotikum je v řadě důlků v plastové destičce v klesající koncentraci. Nejnižší koncentrace,
která inhibuje růst, je MIC. Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen - testování např.
12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích. Pokud například v koncentracích 0,25 - 0,5 - 1 - 2
je přítomen zákal a v koncentracích 4 - 8 - 16 - 32 (vše v mg/l) zákal není, říkáme, že
koncentrace 4 mg/l a vyšší jsou inhibiční - tedy koncentrace 4 mg/l je minimální inhibiční
koncentrace (MIC).
Pokud důlky bez zákalu (tj. s inhibicí) vyučkujeme do půdy bez antibiotika, můžeme pozorovat,
jestli baktérie byly pouze inhibovány, nebo usmrceny. Tím zjistíme hodnotu MBC. Tento postup se
ale v praxi používá výjimečně.
Mikrodiluční test se používá místo difusního diskového testu zejména u pacientů těžce
nemocných, v ohrožení života.
Zjišťování faktorů rezistence
Ne vždycky stačí výše uvedené zjišťování citlivosti či rezistence na antibiotika. Někdy je lépe
speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz.
Může se jednat o diagnostické proužky (chemický průkaz daného enzymu) nebo testy na jiném
principu (u širokospektrých betalaktamáz porovnání velikosti zóny inhibice u téhož antibiotika
s inhibitorem a bez inhibitoru betalaktamázy)
Metody nepřímého průkazu (průkazu protilátek) a
průkazu antigenu (serologické metody): J07 ­ J10
Tyto metody pracují s reakcí ANTIGEN - PROTILÁTKA (za vzniku komplexu). V užším slova smyslu se
někdy za sérologické považují pouze ty reakce, kde se jako vzorek používá sérum, popřípadě
reakce, kde se hledá protilátka.
Jednotlivé sérologické metody se od sebe liší pouze způsobem, jak je detekován komplex
antigenu s protilátkou. Všechny se však dají použít ke všem účelům, dále uvedeným:
* Průkaz antigenu pomocí protilátky - použije se laboratorní protilátka (ze séra pokusného
zvířete) a smíchá se
buďto se vzorkem pacienta, ve kterém hledáme antigen ­ jde o přímý průkaz antigenu
nebo s kmenem, vypěstovaným z pacientova vzorku ­ jde o identifikaci, antigenní analýzu
* Průkaz protilátky pomocí antigenu - použije se laboratorní antigen a smíchá se
s pacientovým sérem
VE VŠECH PŘÍPADECH PLATÍ, ŽE:
* pokud vznikl komplex antigen-protilátka, je reakce pozitivní
* pokud komplex nevznikl, je reakce negativní, něco v ní chybí
Přehled sérologických metod
* Precipitace
* Aglutinace
* Komplementfixační reakce
* Neutralizace
* Reakce se značenými složkami:
Imunofluorescence (IMF)
Radioimunoanalýza (RIA)
Enzymová imunoanalýza (EIA, ELISA)
Imunobloty
Nespecifické antigeny a heterofilní protilátky. U většiny serologických reakcí se pracuje se
specifickými antigeny - například s antigenem spalniček u protilátek proti spalničkám, se
stafylokokovým antigenem u protilátek proti stafylokokům apod. Někdy je ale výhodné při
nepřímém průkazu použít místo skutečného mikrobiálního antigenu nějakou levnější a
bezpečnější látku, o které je známo, že je také schopna vázat příslušnou protilátku: používají se
např. červené krvinky všelijakých zvířat při průkazu infakční mononukleózy (Paul-Bunnellova
reakce). Hovoří se pak o nespecifickém antigenu.
Někdy se také prokazují protilátky, které nejsou namířeny přímo proti mikrobu, ale proti nějaké
molekule, která se uvolňuje z tkání změněných infekcí. Takovou látkou může být například
kardiolipin - extrakt z hovězích srdcí při průkazu syfilis. Protilátky, které se s takovým
nemikrobiálním antigenem spojují, se označují jako heterofilní protilátky.
Jak zjistit u nepřímého průkazu, jestli se jedná o akutní infekci?
Zatímco přímý průkaz (včetně průkazu antigenu a antigenní analýzy!!!) vždy dokazuje přítomnost
mikroba, u nepřímého průkazu tomu tak není. Přítomnost protilátek pouze svědčí o tom, že se
organismus někdy s mikrobem setkal. Přesto je možné aspoň s určitou pravděpodobností říci,
jestli se o akutní infekci jedná, nebo jestli jsou protilátky nalezené v séru pacienta jen následkem
infekce překonané dříve. Je potřeba využít některého z následujících tří způsobů:
* Zjišťujeme, jaké je množství protilátek v séru a jestli se mění. Využívá se toho, že v akutní
fázi infekce množství protilátek prudce stoupá, pak zase klesá, a nakonec se udržuje na
stálé, nízké hladině. Je ovšem těžké zjistit množství protilátek v séru absolutně
(v gramech, v molech). Logicky ale - pokud je v séru hodně protilátek, můžeme takové
sérum mnohonásobně zředit a pořád ještě bude reagovat s antigenem. Pokud je
protilátek málo, bude reagovat jenom neředěné či málo ředěné sérum. Proto se
připravují různá ředění séra (většinou geometrickou řadou: 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80
atd.) a všechna se míchají s antigenem. Tím získáme číslo zvané TITR, které udává,
kolikrát se dá sérum zředit, aby ještě reagovalo s antigenem. Důležitý ale nebývá
samotný titr, ale jeho změna během dvou či tří týdnů. Pokud během se během této
doby titr zvýší aspoň čtyřikrát (= o dvě ředění, například z 20 na 80), jde velmi
pravděpodobně o akutní infekci. Pouhé dvojnásobné zvýšení (= o jedno ředění) může
být náhodné. Zjišťování titrů se používá u precipitací, aglutinací, komplementfixací a
neutralizací (tj. u ,,klasických" serologických reakcí ­ blíže o nich v dalším textu).
* Zjišťujeme, k jaké třídě patří nalezené protilátky - to ovšem umožňují pouze reakce se
značenými složkami (ELISA, imunofluorescence, RIA ­ viz dále). Převaha IgM nad IgG
svědčí pro akutní infekci
* Zjišťujeme tzv. aviditu, to je síla vazby protilátky na antigen. Čerstvé protilátky (u akutní
infekce) bývají nízkoavidní. Tato metoda je poměrně nová a zatím se příliš nepoužívá.
Precipitace a aglutinace ­ J07
Precipitace a aglutinace jsou nejjednodušší metody, protože kromě antigenu a protilátky už
v systému nemusí být nic jiného. Bývají ale méně přesné a dají se použít jen v některých
případech. Komplex se projeví sám jako sraženina (precipitát nebo aglutinát).
Rozdíl mezi precipitací a aglutinací:
* u precipitace je antigen povahy koloidní (jako antigen vystupují jednotlivé makromolekuly)
* u aglutinace je povahy částicové - korpuskulární (jako antigen vystupují větší částečky,
například celé baktérie).
Aglutinace na nosičích je zvláštní případ, vlastně precipitace převedená na aglutinaci. Používá
se tam, kde máme koloidní antigen, ale potřebovali bychom korpuskulární. Řeší se to tak, že
antigen navážeme na vhodnou částici. Jako částice se používají latexové částice - pak se
jedná o latexaglutinaci nebo červené krvinky - pak se jedná o hemaglutinaci (např. TPHA na
syfilis). Tento případ je potřeba odlišit od aglutinace s krvinkou coby nespecifickým antigenem
(například Paul-Bunnellova reakce na infekční mononukleózu). U TPHA je krvinka pasivním
nosičem antigenu, u Paul-Bunnellovy reakce je sama antigenem (i když nespecifickým).
Komplementfixační reakce ­ J08
Komplementfixační reakce je mnohem složitější než předchozí dvě. Používá se při ní
komplement, což je přirozená složka humorální nespecifické, ale vlastně i specifické imunitní
reakci. Každé sérum obsahuje komplement. Pro komplementfixační reakci se ovšem nedá
použít vlastní komplement pacienta, protože jeho množství je nejisté. Proto se vlastní pacientův
komplement před reakcí inaktivuje, a do reakce se přidává komplement morčecí.
V první fázi ke dvěma složkám (laboratorní antigen plus sérum od pacienta - nebo laboratorní
protilátka plus vzorek, ve kterém předpokládáme antigen) přidáme komplement. Pokud je
reakce pozitivní, komplement se naváže na komplex antigenu s protilátkou. Pokud je reakce
negativní, komplement je volný. Na komplementu je zajímavé to, že se neváže ani na
samotnou protilátku, ani na samotný antigen - pouze na komplex, který z antigenu a protilátky
vznikl. Právě proto se používá v rámci diagnostiky - pokud se komplement naváže, je jisté, že
došlo ke vzniku komplexu. Problém je ale v tom, že navázání komplementu na komplex antigenprotilátka
není samo o sobě vidět. Proto musí mít komplementfixační reakce ještě druhou fázi.
Nyní přidáme do reakce tzv. indikátorový systém. Je to soustava známéno antigenu (beraní
erytrocyty) a známé protilátky (takzvaný amboceptor - králičí protilátky proti beraním
erytrocytům). Tato soustava má jednu zajímavost: když se na ni naváže komplement, dojde
k hemolýze erytrocytů. No a v tom je právě onen vtip: pokud se v první fázi všechen
komplement vyvázal na soustavu antigen - protilátka, nezbyl žádný volný komplement a
indikátorový systém zůstane nedotčen. Pokud ale byla reakce negativní, zůstal komplement
volný, váže se na indikátorový systém a hemolyzuje ho. Znamená to, že hemolýza svědčí o
negativitě reakce, nepřítomnost hemolýzy o pozitivitě.
V případě KFR mohou nastat dva problémy:
1) Máme příliš mnoho komplementu a ten se nestačí vysytit (falešně negativní reakce). Aby
nedošlo k této chybě, je třeba komplement před testem vytitrovat.
2) V séru je složka, která sama o sobě inaktivuje komplement (složka zobdpovědná za
antikomplementaritu séra). Reakce v tomto případě může být falešně pozitivní. Kvůli této
chybě se ke každému ředění sér provádí (obvykle v prvním sloupci destičky) test
antikomplementarity. V případě průkazu protilátky test antikomplementarity předpokládá
kompletně proběhlou reakci až na to, že se v úvodu ,,zapomene" přidat antigen. Pokud i
bez antigenu vyjde test ,,pozitivní", je sérum antikomplementární a test je třeba
zopakovat s novým vzorkem séra.
KFR je běžně používaná zejména ve virologii, případě též v diagnostice hub a parazitů, méně
často i baktérií. Ve virologii je to jedna z nejběžnějších metod u většiny běžných virů. U virů se
také používá i k průkazu antigenu, i když méně často než k průkazu protilátek.
Neutralizační reakce ­ J09
V případě virů, které jsou malé, protilátka kromě různých dalších mechanismů účinku působí i
přímo ­ neutralizuje účinek viru na buňku nebo krvinku.
Virus má zálusk na nějakou buňku či krvinku, které by rád provedl nějakou neplechu (u krvinky
např. její shluknutí ­ aglutinaci, u tkáňové kultury cytopatický efekt), ale protilátka mu v tom
zabrání.
Bakterie jsou příliš velké na to, aby je mohla protilátka přímo inaktivovat. Co však protilátka
nezmůže s bakteriemi, zmůže s jejich toxiny. Proto se neutralizační v bakteriologii zpravidla
používají tak, že protilátka neutralizuje účinek bakteriálního toxinu. Výjimkou může být např.
neutralizace pohyblivosti bakterie (u jedné ze starších diagnostických reakcí u syfilis).
Antigenem v neutralizační reakci je tedy zpravidla virus nebo bakteriální toxin.
Některé příklady:
* ASLO - antistreptolyzin O. Prokazujeme protilátku proti streptokokovému toxinu. V tomto
výjimečném případě nám nejde ani tak o toxin, ale o protilátku jako takovou - ona totiž
často nespecificky reaguje s endokardem či ledvinnými glomeruly, vedouc tak
k revmatické horečce či glomerulonefritidě. Antistreptolyzin O neutralizuje lýzu
červených krvinek, kterou by normálně provedl streptolyzin O: to znamená, že
v případě pozitivity (protilátka JE přítomna) nedojde k hemolýze (krvinky sedimentují na
dno důlku), v případě negativity (protilátka NENÍ přítomna) k hemolýze dojde.
* Hemaglutinačně inhibiční test (HIT) se používá ve virologii. Jde o to, že řada virů je
schopna in vitro shlukovat červené krvinky. Je-li však v reakci přítomna specifická
protilátka, je mu v tom schopna zabránit. Pozitivní reakce je tedy taková, kde NEDOJDE
ke shlukování krvinek (krvinky klesají na dno důlku, sedimentujíce).
* Virusneutralizační test (VNT) je velice podobný. Virus pěstujeme na tkáňové kultuře na
dně důlku mikrotitrační destičky. Virus způsobuje cytopatický efekt (CPE), který se
projevuje i změnou metabolismu za použití vhodného indikátoru změnou barvy. I
tady může protilátka viru v efektu zabránit.
Pro jednoduchost jsme v předchozím textu hovořili o průkazu protilátek. Bystří studenti jistě
vymyslí, jak by bylo třeba reakce uspořádat, aby neznámé virové agens či pacientův
vzorek byl míchán s různými známými specifickými protilátkami tak, aby reakce sloužila
k průkazu antigenu.
Reakce se značenými složkami ­ J10
Principem těchto reakcí je nepřerušený řetězec, jehož články jsou antigeny a protilátky; ne
vždy je to jen jeden antigen a jedna protilátka. Řetězec začíná nějakým pevným
povrchem (sklíčko, dno důlku) na který se naváže některá složka reakce, a končí v
pozitivním případě - nějakým "značidlem", které pak může být detekováno. Poslední
složka, na kterou je "značidlo" navázáno (nakonjugováno - bývá to obvykle protilátka), se
zpravidla označuje jako konjugát. V případě negativním jeden článek řetízku chybí, a
proto všechny další, nejsouce pevně svázány s povrchem, mohou být - a také jsou vyplaveny
při takzvaném "promývání". Promývání se dělá po každém novém kroku. Tímto
způsobem nakonec skončí ve výlevce i to "značidlo". Jako ,,značidla" se používají:
* Fluorescenční barvivo. V takovém případě je povrchem zpravidla podložní sklíčko a
výsledný efekt je detekován prostřednictvím fluorescenčního mikroskopu. Výhodou je,
že vidíme např. tvar baktérie. Hovoříme o imunofluorescenci.
* Radioizotop. V tom případě se efekt pozoruje pomocí vhodného přístroje k detekci
radioaktivity. Metoda je náročná, vyžaduje laboratoř vybavenou pro práci
s radioaktivním materiálem. Používá se dnes poměrně málo. Metoda se nazývá
radioimunoassay či radioimunoesej, zkráceně RIA
* Enzym. V tom případě musí následovat ještě další fáze, ve které se přidá substrát
reakce. Pokud je "značidlo" v podobě eznymu přítomno, dojde k rozštěpení substrátu na
produkt, který se buďto liší barvou, nebo jej lze identifikovat s využitím indikátoru.
Povrchem tu bývá dno důlku v panelu a celá reakce se dá snadno automatizovat: čím
silněji reakce proběhla, tím intenzivnější je barevná změna, a tato intenzita barevné
změny je měřitelná jako absorbance ve spektrofotometru. Nejběžnější variantou této
reakce je reakce ELISA - je to zkratka a znamená enzym linked immuno sorbent assay.
ELISy se postupně staly standardními vyšetřovacími metodami u velkého množství
mikrobů, nahradily starší a méně přesné metody.
Imunobloty jsou vlastně speciálním případem reakce ELISA. Od klasické ELISy se výrazně liší
metodou přípravy antigenu.
U klasické ELISy se prostě použije celý mikrob, a s ním pak mají možnost reagovat všechny
protilátky, které jsou kompatibilní s kterýmkoli z antigenů, který se na povrchu mikroba nalézá.
Takových antigenů tam může být mnoho.
Někdy je ale výhodné pracovat se skutečnými jednotlivými antigeny. Je to především tehdy, kdy
máme několik příbuzných mikrobů, které mají některé antigeny shodné a jiné odlišné.
Imunoblotová technika nám umožní antigeny navzájem oddělit a dopídit se zjištění, který z nich
vlastně reagoval.
Antigeny jsou uvolněny z povrchu mikroba, rozděleny elektroforézou podle své hmotnosti a pak,
opět elektroforeticky, přeneseny na speciální fólii. V tu chvíli pak začnou fungovat jako "běžný"
antigen v reakci ELISA, dále už je to tedy všechno stejné.
Metoda se používá například u borrelií - existuje jich několik druhů, které jsou antigenně příbuzné,
ale ne totožné.
Automatizace u serologických metod. Velkou výhodou zejména moderních metod, jako jsou
ELISy a Western blotty, je možnost automatizace. Dnes již existují automaty, které jsou schopny
celou reakci provést samy - hlídají potřebné časy reakcí, přidávají činidla, promývají apod.
Takto funguje např. přístroj "Elisamat", kterému se na mikrobiologii u sv. Anny začalo říkat
"Kryštofek", protože jedna jeho část je od firmy Columbus. Ze začátku s ním byly jisté problémy,
např. do reakce omylem přidal etanol namísto kyseliny sírové. Toto dokumentuje následující
píseň s názvem "Kryštofek".
1. Ten den všechno chystalo se na velikou slávu
jako kdyby měli přivézt posvátnou nám krávu
Chyběly jen prapory a duo Lábus - Kaiser
když měl přijít na serolku slavný minilyzer
Škatulata hejbala se v nebývalé míře
neboť místo dělalo se pro posvátné zvíře
Od těch dob co dorazilo to památné ráno
Všichni se s ním spřátelili, Kryštofek je zváno.
R. Kryštofek nám denně mění všední chvíle v svátky
neobjeví Ameriku, zato protilátky.
/:Bez Kryštofa byli bychom ubožáci málem
Kryštofek je našim velkým elisovým králem!:/
2. Bohužel se naše zvíře z kovu skla a plastu
oddávati začalo nám z ničeho nic chlastu.
Zkrátka místo vitriolu líh mu lépe chutná
Serolka i virolka je z toho celá smutná.
Kryštofek je náročný a ošidit se nedá
a ta jeho obsluha je učiněná věda
Ti co máme rodiny to celkem dobře chápem
S Kryštofkem je stejná práce jak má žena s chlapem Refrén
Molekuláně biologické metody v mikrobiologii téma
J11
Jde o metody, které v klinické mikrobiologii nejsou samospasitelné, ale ani neužitečné; hodí se
k využití v kontextu ostatních metod. Chybou je tedy jak je zavrhovat, tak i ,,zbožšťovat".
Průkaz nukleové kyseliny (NA) je moderní metoda přímého průkazu, která umožňuje identifikovat
i malá množství mikrobů, mikroby usmrcené, nebo dokonce mikroby, u kterých se nezachovala
kompletní buňka či virová částice. Někdy je ovšem tento zvýšený záchyt spíše na škodu. Navíc
je to metoda pořád ještě hodně drahá a náročná. Používá se proto jen u mikrobů, u kterých
klasické metody nelze použít, nebo jsou příliš pomalé.
Průkaz NA (většinou průkaz DNA, u virů občas i RNA) se dělí na
metody bez amplifikace (klasické genové sondy) a
metody s amplifikací (namnožením) určité sekvence nukleové kyseliny.
Nejpoužívanější je dnes POLYMERÁZOVÁ RĚTĚZOVÁ REAKCE (PCR), která patří do druhé skupiny.
Vedle ní se občas používá ještě ligázová řetězová reakce (LCR)
PCR se skládá ze tří fází:
* Rozbití vzorku a izolace DNA ze vzorku
* Vlastní amplifikace
* Detekce produktu elektroforézou nebo reakcí ELISA (nejde o serologickou ELISA reakci)
Podrobnější popis zde neuvádíme, neboť metoda se široce využívá i mimo mikrobiologii a je
náplní učiva jiných předmětů, zejména biologie.
Problémem je, že vzorek může někdy obsahovat látku inhibující reakci.
Prevencí je nepoužívat pro PCR transportní půdy (je to jeden s výjimečných případů, kdy není
doporučena souprava s transportní půdou), vyhývat se talkovaným rukavicím apod. (výčet
všeho inhibujícího je mimo možnosti autora i mimo potřeby tohoto textu). Pro ověření, zda
nedošlo k inhibici, se používá interní kontrola ­ IC. Ta je detekována reakcí ELISA či
imunofluorescencí zejména v případě, že vlastní reakce je negativní. IC je genetický materiál,
který má delší řetězec nukleové kyseliny než produkt, o který nám jde ­ v kompetici by měl mít
reálný produkt přednost před IC. Způsob interpretace v případě elektroforézy ukazuje obrázek,
podobně je tomu i v případě reakce ELISA.
Virologická diagnostika (témata J12 + J13)
Diagnostika virů
Zapamatujte si:
1) Viry se vůbec nediagnostikují tak běžně jako baktérie. Má to několik příčin:
a) mnohé virové nemoci jsou viditelné na pacientovi pouhým okem (spalničky, neštovice)
b) další se léčí symptomaticky (např. respirační nebo střevní virosy) a jejich léčba tedy
nevyžaduje znalost agens
c) i případná znalost agens zpravidla nemění nic na tom, že kauzální antivirotická léčba se
používá výjimečně i prozatím nikdy podle in vitro vyšetření citlivosti (metodiky tohoto typu
jsou teprve ve vývoji)
2) Pokud už diagnostikujeme viry, používáme zpravidla nepřímý průkaz
3) Pokud už používáme přímý průkaz, je to častěji průkaz antigenu než mikroskopie a kultivace
Přehled diagnostiky virů
I. Přímá.
A. Mikroskopie
a) Elektronová (hrubé zařazení viru podle jeho tvaru)
b) optická celých virů - pouze poxviry (velké - 300 nm)
c) optická buněčných inkluzí (vzteklina...)
d) optická - sledování CPE - viz kultivace
B. Kultivace (u virů se spíše hovoří o izolaci)
a) Živé organismy (myši, myšata, bavlníková krysa)
b) Vejce:
ba) Amniový vak (obklopuje zárodek)
bb) Žloutkový vak (vyživuje zárodek; největší je u mladých zárodků)
bc) Allantois (odpadní vak; největší u nejstarších zárodků)
bd) Chorioalantoidní membrána (jediný případ, kdy můžeme vidět výsledek ­ POKY)
c) Tkáňové kultury (TK) - obvykle jsou to buněčné kultury z nádorů nebo z embryonálních buněk,
protože ty mají "zakázané" stárnutí a mohou se tedy množit skoro neomezeně
ca) zvířecího původu
cb) lidského původu (například HeLa buňky)
U kultivace mnohdy není viděte pouhým okem výsledek. Vedle poků je druhou výjimkou
cytopatický efekt u TK, ten se však zdaleka netýká všech případů izolace viru na TK. Obvykle je
tedy nutné pokračování další metodou ­ například prokázat schopnost viru shlukovat krvinky
(Hirstův test) nebo průkazem virového antigenu.
C. Průkaz antigenu (zpravidla ELISA, přímá KFR apod.) je Jedná se o tytéž metody jako u nepřímé
diagnostiky (například u žloutenky B se dá provést ELISA k důkazu HBsAg i k důkazu anti-HBs).
D. Průkaz nukleové kyseliny (zpravidla PCR)
II. Nepřímá:
Aglutinace a precipitace se u virů používají málo.
KFR - ve virologii velmi důležitá
Neutralizace ­ hojně používána, zejména ve formě HIT a VNT ­ viz sérologické
reakce/neutralizace.
ELISA včetně Western blottů (např. hepatitidy). V poslední době má u mnohých virů velký
význam.
KONEC