BC_3h_Enzymy_2010 1
Enzymy a Izoenzymy
Analytika
(Principy metod a klinický význam)
Petr Breinek
2
Enzymy
1. makromolekuly bílkovin
2. biokatalyzátory
• Enzymy snižují aktivační energii
potřebnou pro chemickou reakci
enzymé „ v kvasinkách“
1926 J.Sumner: ureasa (bílkovinná povaha)
1 buňka živých organismů obsahuje až 3000 druhů enzymů
Obecné vlastnosti enzymů
• Proteiny
• Katalyzátory
• Specifický účinek
• Vysoká účinnost:
- účinnost o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů
- reakce s enzymem jsou o 106-1014 rychlejší než bez
enzymu
• Mohou být regulovány
Jak reaguje enzym se substrátem
• vazba substrátu do aktivního místa
vyvolá odpovídající konformační změnu
molekuly enzymu
• vytvoří se komplex enzym-substrát
E + S ES E + P
5
 bílkovinná část apoenzym
 nebílkovinná část kofaktor
Kofaktor:
• Prostetická skupina ( Mg2+, Zn2+, ): pevně vázaná
• Koenzym (NAD+, P5P): disociovatelná molekula
Složení enzymové molekuly
6
• Řada enzymů má stejné nebo velmi podobné
katalytické účinky, liší se v primární struktuře
(složením aminokyselin).
Pokud tyto změny mají genetický základ, tak
tyto rozdílné formy jednoho enzymu
nazýváme izoenzymy
• Liší se fyzikálními, chemickými a
imunologickými vlastnostmi
Izoenzymy
7
• Pokud jsou rozdíly ve struktuře způsobené
sekundárními změnami, např.
- glykosylací
- tvorbou komplexů s imunoglobuliny
- nejsou to izoenzymy!
Makroenzymy
Metody stanovení katalytické
koncentrace aktivity enzymu
Kinetické
• Spektrofotometrické
stanovení rychlosti
enzymové reakce
kontinuálním měřením
absorbance v závislosti na
čase
• Průběžně se měří [S]
nebo [P]
• Řada měření
Konstantního času
-„dvoubodové stanovení“
-„end-point“
• Měří se [P] po
proběhnutí reakce
• Jedno měření
fotometrické sledování změny
absorbance ( přírůstek produktu nebo
úbytek substrátu) za časovou jednotku
(nevíme, co se v reakční směsi děje !),
většinou v daném čase zastavujeme
enzymovou reakci (např. denaturace a
kolorimetrické vybarvení produktů
• nedoporučovány
Množství enzymu v biologickém materiálu
lze vyjádřit dvojím způsobem
Nepřímé stanovení
• katalytická
koncentrace aktivity
• μkat/l
• stanoví se produkt
enzymové reakce
• většina klinicky
významných enzymů
Přímé stanovení
• hmotnostní koncentrace
• μg/l, ng/l
• stanoví se molekula
enzymu jako antigen
(imunochemicky)
• např. tumorové markery,
ALP kostní
10
Optický test
měříme změny absorbance v UV-oblasti
(při 340 nm) způsobené změnami koncentrace
redukovaných forem koenzymů NADH + H+
nebo NADPH + H+
11
A
B
S
O
R
B
A
N
C
E
VLNOVÁ DÉLKA
12
• Katalytická aktivita enzymu
jednotka katal (kat)
definice: 1 kat = 1 mol/s
• Katalytická koncentrace aktivity enzymu
jednotka: kat/l
používané jednotky: kat/l a nkat/l
jiné jednotky: U/l
1 kat/l = 60 U/l 1 U/l = 0,0167 kat/l
Vyjadřování výsledků měření
13
Názvosloví enzymů
 triviální / historické Diastáza
 obecně užívané -Amyláza ( AMS)
 systémové (vědecké)
1,4- -D-glukan glukanohydroláza, EC 3.2.1.1.
ENZYME COMMISSION International Union of Biochemistry and Molecular Biology
EC 3. TYP KATALYZOVANÉ REAKCE
EC 3.2.1. SUBSTRÁTY
EC 3.2.1.1. KATALOGOVÉ ČÍSLO
14
Třídění enzymů
1. Oxidoreduktázy (LD, GLDH, CHOD)
2. Transferázy (AST, ALT, GGT,CK)
3. Hydrolázy (ALP, LPS, AMS, CHE)
4. Lyázy (NSE)
5. Ligázy (syntetázy)
6. Izomerázy
15
1. Teplota ( 25 - 30 - 37 oC)
2. Pufr (pH, iontová síla, typ pufru)
3. Koncentrace substrátu
4. Koncentrace koenzymu
5. Moderátory enzymové aktivity
–inhibitory (kompetitivní a nekompetetivní)
–aktivátory
Často se volí kompromis mezi zjištěnými optimálními
podmínkami, cenou reagencií a technickými požadavky
Faktory ovlivňující enzymovou
reakci
16
koncentrace substrátu
reakční rychlost
Km Michaelisova konstanta
Inhibice enzymů (snížení aktivity)
Ireverzibilní
• inhibitor pevně vázán
na enzym (akt. místo)
• organofosfáty
• ionty těžkých kovů
• kyanidy
Reverzibilní
• inhibitor volně vázán
• rovnováha E+I E-I
• inhibitor lze odstranit (dialýza,
gel. filtrace)
• dva základní typy:
kompetitivní, nekompetitivní
Kompetitivní inhibice
• inhibitor je strukturně podobný substrátu
• váže se do aktivního místa
• soutěží s fyziologickým substrátem
o vazebné místo
Nekompetitivní inhibice
• Inhibitor se váže mimo aktivní centrum
na E i na komplex E-S
• Vmax se snižuje, protože klesá
koncentrace funkčního komplexu E-S
20
Vliv časového intervalu, ve kterém měříme
21
vyčerpání
substrátu
Rozšíření linearity
t1 t2
A
B
A
Čas (t)
R1 R2S
Flex rate
Flex rate
23
• Primární referenční měřící postupy,SOP
• CRM pro enzymy + sekundární CRM
• Mezinárodní srovnání referenčních
laboratoří
• Akreditace kalibračních laboratoří
• Mezinárodní síť referenčních laboratoří
• Společné referenční intervaly a
rozhodovací limity
IFCC standardizace (+37oC)
24
Metody IFCC a primární CRM
GGT IRMM/IFCC 452 (ERM-AD 452)
LD IRMM/IFCC 453 (ERM-AD 453)
ALT IRMM/IFCC 454 (ERM-AD 454)
CK IRMM/IFCC 455 (ERM-AD 455)
AMS IRMM/IFCC 456 (ERM-AD 456)
AST IRMM/IFCC „new“
v přípravě:
ALP a LPS(?)
25
Kalibrace
Primární CRM
Sekundární CRM
Pracovní kalibrátory výrobců
Pracovní kalibrátory uživatelů
(Kalibrační faktor vypočítaný z teoretického
molárního absorpčního koeficientu nebo
stanoveného experimentálně)
26
Předběžné referenční hodnoty
(metody IFCC )
27
AST
L-aspartát + 2-oxoglutarát oxalacetát + L-glutamát
Je obsažena v cytoplasmě(65%) a v
mitochondriích(35%) všech buněk ( zvláště
hepatocytů,buněk srdečního svalu, ledvin a
kosterních svalů)
28
AST
Klinický význam
• onemocnění myokardu (nekróza, AIM)
• jaterní choroby
• onemocnění kosterního svalstva
29
AST
L-aspartát + 2-oxoglutarát oxalacetát + L-glutamát
oxalacetát + NADH + H+ → L-malát + NAD+
MDH
SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při
340 nm
• pyruvát + NADH + H+ L-laktát + NAD+
• koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoAST AST*
• doporučuje se předinkubace 10 min při +37oC
• start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda)
• start : sérum ( 1 činidlová metoda)
Pyridoxalfosfát
je kofaktor transaminací
R CH
NH2
COOH
N
CH2O
H3C
HO
C
OH
P
OH
O
OH
N
CH2OH
H3C
HO
C
OH
Pyridoxal = vitamin
31
ALT
L-alanin + 2-oxoglutarát pyruvát + L-glutamát
Je obsažena v cytoplasmě všech buněk,
zvláště hepatocytů, buněk srdečního svalu,
ledvin a kosterních svalů
32
ALT
Klinický význam
• onemocnění jater (infekční virová hepatitida,
mononukleóza, chronické jaterní choroby,…)
• onemocnění žlučových cest
• dekompenzované srdeční vady (venostáza
v játrech)
• poškození svalstva
33
ALT
L-alanin + 2-oxoglutarát pyruvát + L-glutamát
pyruvát + NADH + H+ L-laktát + NAD+
LD
SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm
• pyruvát + NADH + H+ L-laktát + NAD+
• koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoALT ALT*
• doporučuje se předinkubace 10 min při +37oC
• start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda)
• start : sérum ( 1 činidlová metoda)
34
AMS
štěpí -1,4 glykozidické vazby
POLYSACHARIDY OLIGOSACHARIDY MALTÓZA
AMS je sekreční enzym vytvářený pankreatem a
slinnými žlázami, (část vzniká v játrech, plících)
Sérum obsahuje přibližně stejnou katalytickou
koncentraci pankreatického a slinného izoenzymu.
35
AMS
Klinický význam
• onemocnění pankreatu (akutní pankreatitida)
• onemocnění slinných žláz ( parotitis)
• přítomnost makroamylasového komplexu
• onemocnění jater
• ledvinná nedostatečnost
36
Doporučená metoda IFCC
substrát : EPS-G7-PNP (EPS)
4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)- -(1,4)-D-maltoheptaosid
37
 Maltoheptaosid Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο 7 glukóz
+ -Glukosidáza
 substráty značené 4-nitrofenolem na konci molekuly
Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- 
 na opačném konci molekuly substrátu navázána např.
ethylidenová skupina „blokovaný“ substrát
- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο- Ο-
38
1 molekula EPS
4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)- -(1,4)-D-maltoheptaosidu
7 molekul glukózy + 1 molekula 4-nitrofenolu
SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU
405 nm
39
Izoenzymy AMS
• SLINNÝ
• PANKREATICKÝ
(geneticky podmíněný polymorfismus)
 MAKROAMYLÁZOVÝ komplex = komplexy
glykosylovaných izoenzymů s imunoglobulíny a
jinými bílkovinami v séru
Mr = 400 000 až 2 000 000
způsobuje zvýšení hodnot AMS v krevním
séru
40
Metody stanovení
1. Selektivní INHIBICE isoenzymů monoklonálními
protilátkami, např. stanovení pankreatické AMS
2. ELEKTROFORÉZA
3. CHROMATOGRAFIE
4. IZOELEKTRICKÁ FOKUZACE
5. INHIBIČNÍ metody
41
ALP
monoestery kyseliny o-fosforečné + H2O

alkohol / fenol + fosfátový anion
V séru dospělých zdravých osob převažují jaterní izoenzymy,
u dětí je zvýšena aktivita kostního izoenzymu,
u těhotných žen je detekovatelný placentární izoenzym a
u osob s krevní skupinou 0 a B jsou přítomny stopy střevního
izoenzymu.
Vyskytuje se prakticky ve všech tkáních, je
součástí buněčných membrán
43
Klinický význam:
• onemocnění jater
• onemocnění žlučových cest
• onemocnění kostí
• fyziologicky zvýšené hodnoty: rostoucí děti a
těhotné ženy (max. 3 trimestr těhotenství)
• zánětlivé střevní choroby
44
Metody stanovení:
Substrát: 4-NITROFENYLFOSFÁT
4-NITROFENYLFOSFÁT + H2O →4-NITROFENOL+
fosforečnan
SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU při 405 nm
46
1. Imunochemicky ( kostní izoALP)
2. ELEKTROFORÉZA
3. INAKTIVAČNĚ - INHIBIČNÍ metody
4. srážení LEKTINEM ( kostní izoenzym)
Izoenzymy ALP
47
CK
KREATINFOSFÁT + ADP KREATIN + ATP
V cytoplazmě a mitochondriích buněk
kosterního svalstva, srdce a mozku.
v myokardu: 80% CK-MM a 20% CK-MB
v kosterním svalstvu: 98% CK-MM a 2% CK-MB(!)
48
Klinický význam:
• onemocnění kosterního svalstva
• onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu)
• onemocnění centrální nervové soustavy (CNS)
49
Metody stanovení: IFCC (37 C)
KREATINFOSFÁT + ADP KREATIN + ATP
ATP + D-GLUKOSA ADP + D-GLUKOSO-6-FOSFÁT
HEXOKINASA
D-GLU-6-P + NADP+ D-GLUKONÁT-6-P+NADPH+H+
G6PD
SPEKTROFOTOMETRICKY -nárůst absorbance NADPH při 340 nm
Reaktivace: N-ACETYL CYSTEIN ( NAC)
50
Izoenzymy CK
CK je DIMER skládající se ze 2 podjednotek:
M ( muscle) a B (brain)
kombinací vznikají 3 izoenzymy:CK-MM, CK-MB, CK-BB
je možné detekovat i makroenzym: CK- makro
Izoformy izoenzymů: CK-MB1 a CK-MB2
CK-MM1, CK-MM2 a CK-MM3
51
Metody stanovení:
1. IMUNOCHEMICKY
CK-MB mass (hmotnostní koncentrace)
CK-MB mass: zvyšuje se asi o 1h dříve než CK-MB aktivita
je kardiospecifický
vyšší analytická citlivost stanovení
52
CK-MM M M M M
CK-MB M B M B
CK-BB B B
+ANTI-M
B B
Předpoklad: CK-BB v séru nepřítomen (=0)
potom: pokud CK-BB = 0 (nepřítomen)
a CK-MM = 0 ( inhibice)
stanovíme aktivitu CK-B (tj.polovinu přítomného CKMB)
CK-MB = 2 x CK-B
2. IMUNOINHIBIČNĚ
(s protilátkou proti M-podjednotkám CK)
53
Izoenzymy CK
54
LD
• Cytoplasmatický enzym, který katalyzuje
reakci anaerobní glykolýzy, to vysvětluje
přítomnost LD ve všech tkáních.
pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+
• Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově
specifické
55
Klinický význam:
•onemocnění srdečního svalu (infarkt
myokardu, myokarditida)
•onemocnění svalů
•hemolytická a perniciozní anémie
•onemocnění jaterního parenchymu
•maligní choroby (tumory, leukémie)
Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově
specifické → stanovení dnes slouží spíše k
vyloučení onemocnění
56
Metody stanovení:
1. IFCC (37 C)
Substrát: L-laktát
L-laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H+
SPEKTROFOTOMETRICKY -nárůst absorbance NADH při 340 nm
2. Substrát: pyruvát
pyruvát + NADH + H+ → L-laktát + NAD+
SPEKTROFOTOMETRICKY -pokles absorbance NADH při 340 nm
57
Izoenzymy LD
• Aktivní enzym je tetramér - skládá se ze
4 podjednotek
• Existují 2 druhy podjednotek:
M( muscle/sval) a H (heart/srdce)
• Kombinací vzniká 5 izoenzymů :
LD1 H4
LD2 H3M
LD3 H2M2
LD4 HM3
LD5 M4
58
Izoenzymy LD
59
Detekce elektroforeogramu
L-laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H+
NADH + H+ + tetrazoliová sůl → NAD+ + FORMAZAN
NBT,INT nerozpustný
+ PMS (fenazinmetosulfát)
60
GGT
Katalyzuje přenos -glutamylového zbytku z
-glutamylpeptidů na jiný akceptor (např. peptid
nebo aminokyselinu)
GMT je vázána na cytoplasmatické membrány
epitelu žlučových cest, ledvinných tubulů, jater,
pankreasu, střeva, erytrocytů,…)
V krvi dokazatelný enzym je převážně
jaterního původu.
61
Klinický význam:
• onemocnění jater
• obstrukce žlučových cest
• sekundární nádory jater
• monitorování chronického alkoholismu
(poškození jater alkoholem)
62
1. IFCC (37 C)
Substrát:
-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitranilid (GLUCANE)
GLUCANE + Glygly → GLU-Glygly + 5-A-2NB
5-AMINO-2-NITROBENZOÁT
Glygly = GLYCYLGLYCIN
63
LPS
TRI- a DIACYLGLYCEROLY + H2O → GLYCEROL + 3-,2 MK
Výskyt: pankreatická lipáza
jaterní lipáza
lipoproteinová lipáza,…
64
Klinický význam:
• detekce a vyloučení akutní pankreatitidy
(4-6 h, maximum 24h, 8-14 d normalizace)
• chronická pankreatitida ( relapsující)
• obstrukce pankreatického traktu
65
1. TURBIDIMETRICKÉ:
štěpení emulze trioleinu lipasou za přítomnosti
kolipasy a deoxycholanu, měří se úbytek
absorbance (snížení zákalu) při 340 nm (UV-
oblast)
KOLIPASA je protein secernovaný z pankreatu, váže se s
lipasou 1:1 ke žlučovým kyselinám na povrchu
emulgovaných kapének TG, umožňuje štěpení TG
působením lipasy
66
2. Chromogenní
štěpení syntetických substrátů
a) substrát : 1,2-DIGLYCERID
1,2-diglycerid + H2O → 2-monoglycerid + mastná kyselina
2-monoglycerid + H2O → glycerol + mastná kyselina
glycerol + ATP → glycerol-3-fosfát + ADP
Glycerol-3-fosfát+ O2 → dihydroxyacetonfosfát + H2O2
2 H2O2 + 4-AAP + deriv.fenolu → 4 H2O + barevný derivát
67
b) substrát : 1,2-o-DILAURYL-rac-GLYCERO-3GLUTARIC
ACID-(6 -METHYLRESORUFIN) ESTER
DGGR (patent Roche)
DGGR →
1,2-o-DILAURYL-rac-glycerol +
GLUTARIC ACID-6 -METHYLRESORUFIN ESTER
GLUTARIC ACID-6 - METHYLRESORUFIN ESTER
GLUTARIC ACID + METHYLRESORUFIN
chromogen
SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE METHYLRESORUFINU
při 580 nm
68
CHE
estery CHOLINU + H2O → CHOLIN + příslušná kyselina
• Acetylcholinesterázy
acetylcholin + H2O → CHOLIN + CH3COOH
je obsažena v erytrocytech, mozku, plících,
štěpí přednostně acetylcholin (nervová zakončení)
• Pseudocholinesterázy
pochází z ribosomů jaterních buněk → krev
→ sérum a plazma
hydrolýza
69
Klinický význam:
Patologické je především snížení aktivity.
• poruchy proteosyntézy
- těžké hepatopatie
- hladovění organismu
• otravy (intoxikace) organofosfáty
(nekompetetivní inhibitory)
• vrozené chybění, atypické varianty
70
Metody stanovení:
butyrylthiocholin + H2O → thiocholin + butyrát
thiocholin + DTNB 5-merkapto-2-nitrobenzoová
kyselina
žluté zbarvení
DTNB = kyselina 5,5 dithio-bis-nitrobenzoová
Ellmanovo činidlo
71
Metody stanovení:
acetylthiocholin + H2O → thiocholin + acetát
thiocholin + DTNB 5-merkapto-2-nitrobenzoová
kyselina
72
Enzymy v moči
1. AMS
2. NAG ( N-acetyl-beta-glukózaminidáza)
TUBULÁRNÍ postižení LEDVIN
73
Enzymy -Tumorové markery
NSE
neuronspecifická enoláza
cytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy
(katalyzuje přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát)
TK
thymidinkináza
enzym podílející se na syntéze DNA
ukazatel buněčné proliferace