BC_Lipidy_2h_2010 1 Lipidy Lipoproteiny Apolipoproteiny Petr Breinek 2 Lipidy Lipos = tuk • Význam lipidů v organismu 1) Zdroj zásobní energie alternativní ke glukóze (triacylglyceroly) 2) Součást buněčných membrán (cholesterol, fosfolipidy) 3) Biokatalyzátory, hormony 4) izolační vrstva, ochrana orgánů • Stanovení koncentrace lipidů v krvi nyní bez významu (referenční rozmezí 4,0 - 8,0 g/l) 3 Transport lipidů Krev a lymfatický systém 1. Vazba na specifické proteiny (mastné kyseliny na albumin) 1. Tvorba makromolekulárních komplexů lipidy + apolipoproteiny = lipoproteiny Zásobní lipidy a v buněčných membránách 4 Odběr krve • pacient lačný 12-14h • 2-3 dny má být vynechán alkohol, • krev odebrána bez dlouhé venostázy, • pacient má dodržovat alespoň 2 týdny stávající životní styl Diagnostické rozhodnutí o přítomnosti zvýšeného rizika je možné pouze na podkladě průměru dvou následných měření z dvou odběrů u jednoho pacienta, provedených v intervalu 1-8 týdnů, nejlépe v téže sérii měření. 5 Jaký je stav standardizace metod? 6 Referenční metody Cholesterol ID-GC/MS ID-LC/MS Triacylglyceroly ID-GC/MS HDL cholesterol UC a kvantifikace (CDC) LDL cholesterol UC a kvantifikace (CDC) 7 Referenční metody ApoAI není definována ApoB není definována Lp(a) není definována 8 CRM (Certifikovaný referenční materiál) Cholesterol SRM 909b NIST SRM 911b NIST NIST/SRM 1952a (USA) Triacylglyceroly SRM 909b NIST/SRM 1951a (USA) HDL cholesterol SRM 911a NIST NIST/SRM 1952a (USA) LDL cholesterol SRM 911a NIST NIST/SRM 1952a (USA) 9 ApoAI SP1-01 WHO ApoB SP3-07 WHO Lp(a) IFCC SRM 2B 10 Ultracentrifugace Chylomikrony LDL IDL VLDL HDL ELFO Chylomikrony beta-LP široké beta-LP prebeta-LP alfa-LP Hustota (kg/l) < 0,94 1,063 1,019 1,006 >1,21 Velikost (nm) 10 000 220 315 500 85 Obsah CHOL(%) 3 59 41 17 40 Obsah TG(%) 88 7 32 56 6 Obsah proteinů(%) 1 25 18 10 50 Rozdělení lipoproteinů Lp(a) 11 Chylomikrony (CM) • vznikají v absorpčních buňkách střevní sliznice • nesou TG, CH a lipofilní vitaminy přijaté potravou • obsahují apo-B48, stopy apoA (jiné neumí střevní buňka syntetizovat) • syntéza apo-B 48 limituje tvorbu CM • pronikají do lymfy • prostřednictví lymfatických cév jsou transportovány do krve 12 Jaký je osud chylomikronů v krvi ? • do krve vstupují 1-2 h po jídle • z HDL jsou na CM přenášeny Apo E a Apo CII • v krevních kapilárách na CM působí lipoproteinová lipáza 15 • V krevních kapilárách působí na VLDL lipoproteinová lipasa • Triacylglyceroly jsou štěpeny na mastné kyseliny a glycerol • Z HDL jsou na VLDL přenášeny Apo E a Apo CII • VLDL se mění na IDL • IDL jsou vychytány játry nebo přeměněny na LDL Jaké jsou další změny VLDL? 16 • vznikají z VLDL a IDL LDL 17 • oxidované LDL dlouhý poločas LDL částic způsobuje, že: LDL mohou pronikat cévní stěnou ukládají se v intimě dochází k jejich oxidaci oxidované LDL jsou silně aterogenní •„small dense LDL particles“ (malé denzní LDL částice) LDL-III, 1,04-1,06 g/l, <25 nm - silně aterogenní, snadněji pronikají arteriální intimou - špatné rozpoznávání a vychytávání LDL receptory, - snadno se oxidují 18 • IDL i LDL částice mohou být obohacovány estery cholesterolu z HDL • IDL částice jsou vychytávány játry pomocí Apo-E receptoru • LDL jsou vychytávány periferními tkáněmi a játry receptorově zprostředkovanou endocytozou (ApoB 100) Jaký je osud IDL a LDL? 19 Uvolnění cholesterolu z LDL do buňky Vychytávání LDL pomocí specifických receptorů LDL Buněčná membrána Recyklace receptoru Fůze s lyzosomem LDL receptor Specifická interakce mezi Apo-B100 a receptorem 20 Regulace hladiny cholesterolu v buňce 1. regulace příjmu (zvýšená hladina cholesterolu v buňce reguluje počet LDL-receptorů) 2. regulace syntézy cholesterolu regulace tvorby HMG-CoA synthasy inhibice HMG-CoA –reduktasy cholesterolem 21 HDL • vznikají v hepatocytech (částečně i v enterocytech) • HDL přijímají cholesterol z periferních tkání a zprostředkují jeho transport do jater • pro jejich funkci je důležitý enzym LCAT lecitincholesterolacyltransferáza – esterifikace cholesterolu • existuje několik typů HDL (HDL1 – HDL3), které se liší velikostí a obsahem lipidů 22 HO • LCAT přenáší mastnou kyselinu na OH skupinu cholesterolu • Cholesterol se esterifikuje, esterifikovaný cholesterol je méně polární a zanořuje se do nitra HDL CH2 O CO CH CH2 O O P O O O CO CH2 CH2 N CH3 CH3 CH3+ Funkce LCAT - 23 Jak HDL přejímá cholesterol ze tkání? • Interakce malých HDL (HDL3) s povrchem buňky prostřednictvím Apo A1 • Transportu cholesterolu se zúčastní ABC1 transportér v buňkách (ATP-binding casette protein A1) • Vysoké hladiny HDL-cholesterolu = prognosticky příznivý faktor pro riziko koronárních onemocnění 24 Lp(a) • Lipoprotein o nízké hustotě • Kromě Apo B100 má navíc Apo(a) • Apo(a) je podobný plasminogenu • Polymorfismus (hustotní a délkový) • Koncentrace Lp(a) v krvi dána geneticky 25 Lp(a) • Rizikový faktor rozvoje aterosklerózy • Působí nezávisle na ostatních vlivech • Referenční rozmezí: 0,06-0,30 g/l 26 MEZI LIPOPROTEINY PROBÍHÁ VÝMĚNA LIPIDŮ I PROTEINŮ 27 Stanovení lipoproteinů 1) ULTRACENTRIFUGACE 28 2) ELEKTROFORÉZA 29 3) SELEKTIVNÍ PRECIPITACE 30 4) IMUNOSEPARACE 31 Apolipoproteiny • PROTEINOVÁ SLOŽKA LIPOPROTEINŮ • FUNKCE: AKTIVÁTORY A INHIBITORY ENZYMŮ interakce s RECEPTORY tvorba buněčných STRUKTUR 32 ApoAI apolipoprotein v HDL ApoB-100 apolipoprotein v LDL a VLDL ApoB-48 apolipoprotein v chylomikronech Apo(a) apolipoprotein v Lp(a) 33 Význam stanovení ApoB-100 Informace o počtu LDL částic  1 částice LDL obsahuje 1 částici Apo-B100 a různé množství cholesterolu a triacylglycerolů  Při stejné hodnotě LDL cholesterolu vyšší hodnota Apo-B100 svědčí o větším počtu LDL částic (převaha malých hustších částic)  Posouzení rizika kardiovaskulárních následků aterosklerózy 34 Stanovení ApoAI a ApoB 1) IMUNOTURBIDIMETRIE 2) IMUNONEFELOMETRIE • Referenční metody nejsou definovány • CRM: SP1-01 a SP3-07 35 Cholesterol bílá krystalická látka 36 Cholesterol celkový = Cholesterol +Cholesterol esterifikovaný 37 Stanovení cholesterolu 1. Referenční metoda (ID-GC/MS) 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony kalibrátor NIST-SRM 911b vnitřní standard (3,4-13C2) cholesterol derivatizace TMS(trimethylsilylether) m/z analyt 458 m/z vnitřní standard 460 CV(průměr) 0,8% bias -0,5% (-1,4 až + 0,5%) Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 38 Cholesterol 2. Enzymové stanovení • Hydrolýza esterů cholesterolu (CHE, cholesterolesterasa) • Oxidace cholesterolu (CHOD, cholesteroloxidasa) • Barevná reakce (oxidační kopulace) (POD, peroxidasa + chromogen, Trinderova reakce) 39 estery cholesterolu + H2O cholesterol + mastné kyseliny (CHE) cholesterol + O2 Δ4-cholesten-3-on + H2 O2 (CHOD) H2 O2 + chromogen H2 O2 + barvivo (POD) H2 O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu chinoniminové barvivo + 4 H2O 40 Stanovení HDL cholesterolu 1. Referenční metoda Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu 1) odstranění VLDL ze séra ultracentrifugací 2) odstranění IDL,LDL, a Lp(a) precipitací činidlem MnCl2+heparin a centrifugací 3) stanovení cholesterolu v supernatantu referenční metodou Abell-Kendall Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 41 HDL cholesterol 2. HOMOGENNÍ (přímé) metody a) Imunoseparace (Wako) (protilátky proti lidským ß-lipoproteinům b) Maskování (Daiichi) (polyanionové polymery) c) Modifikované enzymy a maskování (Kyowa) (enzymy modifikované PEGem + sulfáty cyklodextrinu) 42 CM VLDL LDL HDL HDL Cholestenon + H202 barevný produkt + H20 DETERGENT CHE + CHOD + protilátka proti lidským ß lipoproteinům + CHROMOGEN Peroxidáza CM VLDL LDL 43 CM VLDL LDL HDL CM VLDL LDL HDL Cholestenon + H202 H20 + 02 HDL DETERGENT CHE + CHOD Činidlo 1 KATALASA 44 HDL Cholestenon + H202 barevný produkt + H20 „Uvolňovací“ DETERGENT CHE + CHOD + CHROMOGEN Činidlo 2 PEROXIDASA HDL 45 Stanovení LDL cholesterolu 1. Referenční metoda Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu 1) odstranění VLDL a chylomikronů ze séra ultracentrifugací (v supernatntu zůstane směs LDL+HDL o hustotě nad 1,006 kg/l) 2) stanovení cholesterolu v supernatantu (LDL+HDL) Abell-Kendallovou metodou 3) odstranění LDL precipitací činidlem MnCl2-heparin v druhé části supernatantu 4) stanovení cholesterolu po centrifugaci v supernatantu (HDL) Abell-Kendallovou metodou 5) výpočet LDL cholesterolu podle vztahu: LDLChol=(LDL+HDL)Chol - HDLChol Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 46 LDL cholesterol 2. HOMOGENNÍ(přímé) metody a) metody s maskováním non-LDL částic • maskování VLDL a chylomikronů cyklodextrinsulfátem • oddělení HDL od LDL detergentem • stanovení cholesterolu v LDL • detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení 47 b) metody s odstraněním non-LDL částic • Rozložení non-LDL částic za přítomnosti detergentu a polyaniontu, za přítomnosti CHE a CHOD proběhne stanovení cholesterolu na peroxid vodíku, který je rozložen katalasou bez tvorby zbarvení • po přidání 2.reagencie obsahující detergent dojde k solubilizaci LDL a enzymovému stanovení cholesterolu z LDL částic (detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení) 48 3. Výpočet koncentrace LDL cholesterolu(Friedewald) LDLChol(mmol/l) = Celkový Cholesterol - HDLChol - 0,45.TG • nutné stanovit HDLcholesterol, celkový cholesterol a TG • neplatí při hyperTG • požadavek 12-14h lačnění 49 Vypočítané parametry • LDL-cholesterol (Friedewald) LDL-Chol=celkový Chol-HDL-Chol-TG.0,45 • Non-HDL-cholesterol celkový CHOL-HDLcholesterol • Aterogenní index (celkový cholesterol-HDLcholesterol)/HDLcholesterol • Chol/HDL 50 Doporučené hodnoty • LDL-cholesterol (Friedewald) 1,2-3,0 mmol/l • Non-HDL-cholesterol <3,8 • Aterogenní index <3,8 • Chol/HDL <5,0 51 Triacylglyceroly Triacylglyceroly = estery glycerolu Problémy při stanovení: volný glycerol diacylglyceroly monoacylglyceroly 52 Triacylglyceroly 53 Stanovení triacylglycerolů 1. Referenční metoda (ID-GC/MS) 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony kalibrátor NIST-SRM 1595 tripalmitin vnitřní standard (13C3) tripalmitin derivatizace N-ethyl-N-trimethylsilylfluoroacetamid) m/z analyt 215 hlavní měření 185,231(konfirmační měření) m/z vnitřní standard 218-187,234(konfirmační měření) CV(průměr) 0,57% nativní sérum-0,72% lyof. sérum bias(diference od SRM 909) 0,10-0,25% lyofilizované sérum 0,14-0,45% nativní sérum Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 54 Triacylglyceroly 2. Enzymové stanovení • Hydrolýza (vznik glycerolu) • Fosforylace (vznik glycerol-3-fosfátu) a) Oxidace glycerol-3-fosfátu barevná reakce b) Stanovení ADP stanovení pyruvátu (optický test) 55 triacylglyceroly + 3H2O glycerol + 3 mastné kyseliny LIPASA glycerol + ATP glycerol-3-fosfát + ADP GLYCEROLKINASA (GK) glycerol-3-fosfát + O2 dihydroxyacetonfosfát +H2O2 GLYCEROLFOSFÁTOXIDASA (GPO) 2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu chinoniminové barvivo + 4 H2O PEROXIDASA (POD) 56 glycerol + ATP glycerol-3-fosfát + ADP GLYCEROLKINASA (GK) ADP + fosfoenolpyruvát ATP + pyruvát PYRUVÁTKINASA (PK) pyruvát + NADH +H+ laktát + NAD + LAKTÁTDEHYDROGENASA (LD) 57 Doporučené hodnotící meze Analyt Muži Ženy Cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 1,20 3,00 HDL cholesterol (mmol/l) 1,00 2,10 1,20 2,70 Apo A1 (g/l)* 1,00 1,70 1,10 1,90 Apo B (g/l)* 0,50 1,00 0,50 1,00 Klinická biochemie a metabolismus, 1 (2010) 45-46