BC_Enzymy_10102009 1 Enzymy a Izoenzymy Principy metod a klinický význam Petr Breinek breinek@seznam.cz 2 Literatura ØDoporučení odborných společností www.cskb.cz ČSKB_vzdělávání 3 ØJiné zdroje - www.labtestonline.cz Lab Tests Online 4 ØJiné zdroje - www.sekk.cz SEKK 5 ÚVOD 1.makromolekuly bílkovin 2.biokatalyzátory • •snižují aktivační energii potřebnou pro chemickou reakci • •Enzym + Substrát « komplex ES ® Produkt + Enzym • • • • • 1 buňka živých organismů obsahuje až 3000 druhů enzymů enzymé „ v kvasinkách“ 1926 J.Sumner: ureasa (bílkovinná povaha) 6 •Řada enzymů má stejné nebo velmi podobné katalytické účinky, liší se v primární struktuře (složením aminokyselin). • Pokud tyto změny mají genetický základ, tak tyto rozdílné formy jednoho enzymu nazýváme izoenzymy • •Liší se fyzikálními, chemickými a imunologickými vlastnostmi • Izoenzymy 7 •Pokud jsou rozdíly ve struktuře způsobené sekundárními změnami, např. • - glykosylací • - tvorbou komplexů s imunoglobuliny • • takové formy enzymů nazýváme makroenzymy (nejsou to izoenzymy!) Makroenzymy 8 •Podle místa působení: • - extracelulární (krev, likvor,…) • - intracelulární (cytoplazma, buněčné organely) • •Podle formy výskytu: • - rozpuštěné, volné • - imobilizované ( např. na buněčných membránách) • - neaktivní proenzymy (zymogeny-např. pepsinogen, protrombin,…) • - izoenzymy • - asociované (multienzymové komplexy) 9 • Øbílkovinná část apoenzym Ønebílkovinná část kofaktor • • Kofaktor: •Prostetická skupina ( Mg2+, Zn2+, ): pevně vázaná •Koenzym (NAD+, P5P): disociovatelná molekula Složení enzymové molekuly 10 Metody stanovení 1.Katalytická koncentrace aktivity enzymů 4Spektrofotometrické metody • - Kinetické měřící postupy • - (end-point) 4(Titrační,aj.) 2. 2.Hmotnostní koncentrace enzymů 4Imunoanalytické metody • 11 • Kinetické měřící postupy • spektrofotometrické stanovení rychlosti enzymové reakce kontinuálním měřením absorbance v závislosti na čase • • 12 • Optický test • měříme změny absorbance v UV-oblasti • (při 340 nm) způsobené změnami koncentrace redukovaných forem koenzymů NADH + H+ nebo NADPH + H+ NAD NADH 13 Princip optický test ABSORBANCE VLNOVÁ DÉLKA 14 • • Katalytická aktivita enzymu jednotka katal (kat) definice: 1 kat = 1 mol/s • Katalytická koncentrace aktivity enzymu jednotka: kat/l používané jednotky: mkat/l a nkat/l jiné jednotky: U/l 1 mkat/l = 60 U/l 1 U/l = 0,0167 mkat/l Vyjadřování výsledků měření 15 Enzymy Km koncentrace substrátu reakční rychlost Km Michaelisova konstanta Km(Michaelisova konst.)= koncentraci substrátu, při které je rychlost reakce rovna polovině maximální rychlosti reakce. 16 •1. Teplota ( 25 - 30 - 37 oC) •2. Pufr (pH, iontová síla, typ pufru) •3. Koncentrace substrátu •4. Koncentrace koenzymu •5. Moderátory enzymové aktivity –inhibitory (kompetitivní a nekompetetivní) –aktivátory • • • často se volí kompromis mezi zjištěnými optimálními podmínkami, cenou reagencií a technickými požadavky Faktory ovlivňující enzymovou reakci 17 Enzymy prubeh 1 Vliv časového intervalu, ve kterém měříme 18 Enzymy prubeh 2 vyčerpání substrátu 19 •Jak se to podařilo? •Referenční metody IFCC •Návaznost rutinních metod na referenční metody •Certifikovaný referenční materiál (CRM) •Mezinárodní síť referenčních laboratoří •Existence referenčních intervalů Velmi dobrá srovnatelnost výsledků 20 Metody IFCC a primární CRM •GGT IRMM/IFCC 452 (ERM-AD 452) •LD IRMM/IFCC 453 (ERM-AD 453) •ALT IRMM/IFCC 454 (ERM-AD 454) •CK IRMM/IFCC 455 (ERM-AD 455) •AMS IRMM/IFCC 456 (ERM-AD 456) •AST IRMM/IFCC „new“ • •v přípravě: •ALP a LPS 21 •Primární referenční měřící postupy,SOP •CRM pro enzymy + sekundární CRM •Mezinárodní srovnání referenčních laboratoří •Akreditace kalibračních laboratoří •Mezinárodní síť referenčních laboratoří •Společné referenční intervaly a rozhodovací limity • IFCC standardizace (+37oC) 22 KALIBRACE enzymových metod * Primární CRM * Sekundární CRM * Pracovní kalibrátory výrobců • * Pracovní kalibrátory uživatelů • • (Kalibrační faktor vypočítaný z teoretického molárního absorpčního koeficientu nebo stanoveného experimentálně) • 23 AST •L-aspartát + 2-oxoglutarát « oxalacetát + L-glutamát Je obsažena v cytoplasmě(65%) a v mitochondriích(35%) všech buněk ( zvláště hepatocytů,buněk srdečního svalu, ledvin a kosterních svalů) 24 AST Klinický význam • onemocnění myokardu (nekróza, AIM) • jaterní choroby • onemocnění kosterního svalstva 25 AST •L-aspartát + 2-oxoglutarát « oxalacetát + L-glutamát •oxalacetát + NADH + H+ → L-malát + NAD+ • MDH • •SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm • pyruvát + NADH + H+ Þ L-laktát + NAD+ •koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoAST Þ AST* •doporučuje se předinkubace 10 min při +37oC • start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda) •start : sérum ( 1 činidlová metoda) 26 ALT • • L-alanin + 2-oxoglutarát Û pyruvát + L-glutamát • • • • • Je obsažena v cytoplasmě všech buněk, zvláště hepatocytů, buněk srdečního svalu, ledvin a kosterních svalů • 27 ALT Klinický význam • onemocnění jater (infekční virová hepatitida, mononukleóza, chronické jaterní choroby,…) • onemocnění žlučových cest • dekompenzované srdeční vady (venostáza v játrech) • poškození svalstva 28 ALT •L-alanin + 2-oxoglutarát Û pyruvát + L-glutamát •pyruvát + NADH + H+ Þ L-laktát + NAD+ • LD • •SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm • •pyruvát + NADH + H+ Þ L-laktát + NAD+ •koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoALT Þ ALT* •doporučuje se předinkubace 10 min při +37oC • start : 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda) •start : sérum ( 1 činidlová metoda) 29 AMS •štěpí a-1,4 glykozidické vazby • •POLYSACHARIDY Þ OLIGOSACHARIDY Þ MALTÓZA • • AMS je sekreční enzym vytvářený pankreatem a slinnými žlázami, (část vzniká v játrech, plících) • Sérum obsahuje přibližně stejnou katalytickou koncentraci pankreatického a slinného izoenzymu. 30 • • doporučená metoda IFCC: substrát (EPS-G7-PNP) •4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)-a-(1,4)-D-maltoheptaosid • 31 •1 molekula EPS •4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1)-a-(1,4)-D-maltoheptaosidu 4. • •7 molekul glukózy + 1 molekula 4-nitrofenolu • •SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU 405 nm • 32 AMS Klinický význam • onemocnění pankreatu (akutní pankreatitida) • onemocnění slinných žláz ( parotitis) • přítomnost makroamylasového komplexu • onemocnění jater • ledvinná nedostatečnost 33 Izoenzymy AMS • SLINNÝ • PANKREATICKÝ • (geneticky podmíněný polymorfismus) •4 MAKROAMYLÁZOVÝ komplex = komplexy glykosylovaných izoenzymů s imunoglobulíny a jinými bílkovinami v séru • Mr = 400 000 až 2 000 000 • Þ způsobuje zvýšení hodnot AMS v krevním séru 34 •Metody stanovení 1.SELEKTIVNÍ INHIBICE isoenzymů monoklonálními protilátkami, např. stanovení pankreatické AMS 2.ELEKTROFORÉZA 3.CHROMATOGRAFIE 4.IZOELEKTRICKÁ FOKUZACE 5.INHIBIČNÍ metody • 35 LPS TRI- a DIACYLGLYCEROLY + H2O → GLYCEROL + 3-,2 MK Výskyt: pankreatická lipáza jaterní lipáza lipoproteinová lipáza,… 36 3. CHROMOGENNÍ (fotometrické) štěpení syntetických substrátů a) substrát : 1,2-DIGLYCERID 1,2-diglycerid + H2O → 2-monoglycerid + mastná kyselina 2-monoglycerid + H2O → glycerol + mastná kyselina glycerol + ATP → glycerol-3-fosfát + ADP Glycerol-3-fosfát+ O2 → dihydroxyacetonfosfát + H2O2 2 H2O2 + 4-AAP + deriv.fenolu → 4 H2O + barevný derivát 37 b) substrát : 1,2-o-DILAURYL-rac-GLYCERO-3-GLUTARIC ACID-(6´-METHYLRESORUFIN) ESTER DGGR (patent Roche) DGGR → 1,2-o-DILAURYL-rac-glycerol + GLUTARIC ACID-6´-METHYLRESORUFIN ESTER GLUTARIC ACID-6´- METHYLRESORUFIN ESTER Þ GLUTARIC ACID + METHYLRESORUFIN chromogen SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE METHYLRESORUFINU při 580 nm 38 ALP monoestery kyseliny o-fosforečné + H2O b alkohol / fenol + fosfátový anion V séru dospělých zdravých osob převažují jaterní izoenzymy, u dětí je zvýšena aktivita kostního izoenzymu, u těhotných žen je detekovatelný placentární izoenzym a u osob s krevní skupinou 0 a B jsou přítomny stopy střevního izoenzymu. Vyskytuje se prakticky ve všech tkáních, je součástí buněčných membrán 39 Klinický význam: • onemocnění jater • onemocnění žlučových cest • onemocnění kostí • fyziologicky zvýšené hodnoty: rostoucí děti a těhotné ženy (max. 3 trimestr těhotenství) • zánětlivé střevní choroby 40 Metody stanovení: Substrát: 4-NITROFENYLFOSFÁT 4-NITROFENYLFOSFÁT + H2O →4-NITROFENOL+ fosforečnan SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU při 405 nm 41 •pufr AMP ( 2-amino-2-methyl-propanol) •pufr MEG ( N-methylglukamin) • 42 1.IMUNOCHEMICKY ( kostní ALP) 2.ELEKTROFORÉZA 3.INAKTIVAČNĚ - INHIBIČNÍ metody 4.srážení LEKTINEM ( kostní izoenzym) • Izoenzymy ALP 43 CK KREATINFOSFÁT + ADP « KREATIN + ATP V cytoplazmě a mitochondriích buněk kosterního svalstva, srdce a mozku. v myokardu: 80% CK-MM a 20% CK-MB v kosterním svalstvu: 98% CK-MM a 2% CK-MB(!) 44 Klinický význam: • onemocnění kosterního svalstva • onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu) • onemocnění centrální nervové soustavy (CNS) 45 Metody stanovení: 1.IFCC (37°C) KREATINFOSFÁT + ADP Þ KREATIN + ATP ATP + D-GLUKOSA Þ ADP + D-GLUKOSO-6-FOSFÁT HEXOKINASA D-GLU-6-P + NADP+ Þ D-GLUKONÁT-6-P+NADPH+H+ G6PD SPEKTROFOTOMETRICKY -nárůst absorbance NADPH při 340 nm REAKTIVACE: doporučuje se N-ACETYL CYSTEIN ( NAC) 46 Izoenzymy CK CK je DIMER skládající se ze 2 podjednotek: M ( muscle) a B (brain) kombinací vznikají 3 izoenzymy:CK-MM, CK-MB, CK-BB je možné detekovat i makroenzym: CK- makro Izoformy izoenzymů: CK-MB1 a CK-MB2 CK-MM1, CK-MM2 a CK-MM3 47 Metody stanovení: 1.IMUNOCHEMICKY CK-MB mass (hmotnostní koncentrace) CK-MB mass: zvyšuje se asi o 1h dříve než CK-MB aktivita je kardiospecifický vyšší analytická citlivost stanovení 48 Předpoklad: CK-BB v séru nepřítomen (=0) potom: pokud CK-BB = 0 (nepřítomen) a CK-MM = 0 ( inhibice) stanovíme aktivitu CK-B (tj.polovinu přítomného CKMB) CK-MB = 2 x CK-B 2. IMUNOINHIBIČNĚ (s protilátkou proti M-podjednotkám CK) 49 Izoenzymy CK 50 LD •Cytoplasmatický enzym, který katalyzuje reakci anaerobní glykolýzy, to vysvětluje přítomnost LD ve všech tkáních. • pyruvát + NADH + H+ « laktát + NAD+ • •Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické LD 51 Klinický význam: •onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu, myokarditida) •onemocnění svalů •hemolytická a perniciozní anémie •onemocnění jaterního parenchymu •maligní choroby (tumory, leukémie) Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické → stanovení dnes slouží spíše k vyloučení onemocnění 52 Metody stanovení: 1. 1.IFCC (37°C) Substrát: L-laktát L-laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H+ SPEKTROFOTOMETRICKY -nárůst absorbance NADH při 340 nm 2. 2.Substrát: pyruvát pyruvát + NADH + H+ → L-laktát + NAD+ SPEKTROFOTOMETRICKY -pokles absorbance NADH při 340 nm 53 Referenční hodnoty •< 4,2 µkat/l (konsensus DGKL) • •1,72 – 3,50 µkat/l (studie NORIP,2002) • •muži < 4,13 (4,05 – 4,22) µkat/l • ženy < 4,12 (4,07 – 4,25) µkat/l • (Schumann G., 2003) • věk 17r • 97,5tý percentil referenčního kolektivu • (90% interval spolehlivosti 97,5tého percentilu) 54 Izoenzymy LD •Aktivní enzym je tetramér - skládá se ze 4 podjednotek • •Existují 2 druhy podjednotek: • M( muscle/sval) a H (heart/srdce) • •Kombinací vzniká 5 izoenzymů : • LD1 H4 LD2 H3M LD3 H2M2 LD4 HM3 LD5 M4 55 detekce elektroforeogramu L-laktát + NAD+ → pyruvát + NADH + H+ NADH + H+ + tetrazoliová sůl → NAD+ + FORMAZAN NBT,INT nerozpustný + PMS (fenazinmetosulfát) Metody stanovení: 1.ELEKTROFORÉZA 56 Izoenzymy LD 57 GGT Katalyzuje přenos g-glutamylového zbytku z g-glutamylpeptidů na jiný akceptor (např. peptid nebo aminokyselinu) GMT je vázána na cytoplasmatické membrány epitelu žlučových cest, ledvinných tubulů, jater, pankreasu, střeva, erytrocytů,…) V krvi dokazatelný enzym je převážně jaterního původu. 58 Klinický význam: • onemocnění jater • obstrukce žlučových cest • sekundární nádory jater • monitorování chronického alkoholismu (poškození jater alkoholem) 59 1.IFCC (37°C) Substrát: g-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitranilid (GLUCANE) • GLUCANE + Glygly → GLU-Glygly + 5-A-2NB 5-AMINO-2-NITROBENZOÁT Glygly = GLYCYLGLYCIN 60 CHE estery CHOLINU + H2O → CHOLIN + příslušná kyselina • Acetylcholinesterázy acetylcholin + H2O → CHOLIN + CH3COOH je obsažena v erytrocytech, mozku, plících, štěpí přednostně acetylcholin (nervová zakončení) • Pseudocholinesterázy pochází z ribosomů jaterních buněk → krev → sérum a plazma hydrolýza 61 Klinický význam: Patologické je především snížení aktivity. • poruchy proteosyntézy - těžké hepatopatie - hladovění organismu • otravy (intoxikace) organofosfáty (nekompetetivní inhibitory) • vrozené chybění, atypické varianty 62 Metody stanovení: butyrylthiocholin + H2O → thiocholin + butyrát thiocholin + DTNB Þ 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina žluté zbarvení DTNB = kyselina 5,5´dithio-bis-nitrobenzoová Ellmanovo činidlo 63 Metody stanovení: acetylthiocholin + H2O → thiocholin + acetát thiocholin + DTNB Þ 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina 64 Enzymy v moči 1. AMS 2. NAG ( N-acetyl-beta-glukózaminidáza) TUBULÁRNÍ postižení LEDVIN 65 Tumorové markery NSE neuronspecifická enoláza cytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy (katalyzuje přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát) TK thymidinkináza enzym podílející se na syntéze DNA ukazatel buněčné proliferace