BC_1h_HbA1c_27102010 1
Glykovaný hemoglobin
HbA1c
Petr Breinek
2
Názvosloví
HbA1c
βN-1-deoxyfruktosyl hemoglobin
DOF hemoglobin
stabilní adukt glukózy s N-terminální
aminoskupinou valinu β-řetězce
hemoglobinu
3
Návrh (IFCC-IUPAC C-NPU):
Hemoglobin beta chain(Blood)-N-(1deoxyfructos-1-yl)hemoglobin
beta chain
Jednotky: místo % → mmol/mol
4
Vyšetření se užívá ke:
• Sledování stavu diabetu mellitu
• Kontrole účinnosti léčby
HbA1c
5
• Udržet koncentraci glukózy co nejblíže
fyziologickým – normálním hodnotám
• Snížit riziko diabetických komplikací
(zrak, ledviny, kardivaskulární a nervové
choroby)
Cíl léčby diabetu
6
 HbA1c odpovídá dlouhodobému stavu
koncentrace glukózy v krvi (průměrný
poločas života erytrocytů je 60 dní → koncentrace
HbA1c odráží průměrnou koncentraci glukózy v
průběhu předcházejících 2-3 měsíců)
 HbA1c neodpovídá aktuální hodnotě
glykémie, jejímu poklesu nebo zvýšení
(glykémie může velmi kolísat beze změn HbA1c)
Co je vyšetřováno?
7
 Přítomnost abnormálního typu hemoglobinu
(např. thalasemie)
 Hemolýza
 Těžké krvácení
Co může ovlivnit hodnocení
vyšetření HbA1c
8
Glykace proteinů
chemická vazba sacharidů na N-koncové
aminokyseliny proteinů (neenzymová reakce)
in vivo- vznikají glykované (modifikované)
proteiny se závažnými patobiochemickými
důsledky
in vitro- hnědnutí proteinů v přítomnosti
sacharidů
9
Glykovaný hemoglobin
Vzniká glykací- neenzymovým navázáním
glukózy k hemoglobinu
Erytrocyt
Glukóza
Hemoglobin
10
HbA0
HbA1c
Val His Leu Thr Pro Glu
Gluc Val His Leu Thr Pro Glu
Glu Lys Ser
. . . .
Glu Lys Ser
. . . .
HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce
hemoglobinu
Glykována je
první AK - Val
ß-chain
11
Glykace hemoglobinu
- rychlá tvorba labilní Schiffovy báze
- pomalý Amadoriho přesmyk za vzniku
stabilního ketoaminu
- H2O
Glukosa Aldimin
(Schiffova báze)
Amadoriho
přesmyk
Ketoamin
Hb-N
CH
C
C
C
C
CH2OH
H
OH
OH
H
H
HO
H
2
O
Hb-N
C H
C
C
C
C
CH2OH
OH
H
OH
OH
H
H
H
HO
Hb-NH 2 + O
C H
C
C
C
C
CH2OH
OH
H
OH
OH
H
H
H
HO
12
Karbonylové skupiny produktů glykace
zvolna reagují s aminoskupinami dalších
proteinů za vzniku vysokomolekulárních
tzv. produktů pozdních fází glykace
(AGE, advanced glycation end-products)
AGE
14
Faktory ovlivňující
neenzymovou glykaci proteinů
• koncentrace sacharidů a proteinů a
jejich kolísání
(koncentrace proteinů v krvi relativně
konstantní, rychlost glykace je úměrná
koncentraci sacharidů)
• doba expozice
• biologický poločas daného proteinu
• teplota
15
Hemoglobiny
Hb
HbA0 HbA1
HbA1a HbA1b HbA1c
HbA
( ßß)
HbA2
( )
HbF
( )
96% <2%2-3%
Normální
Hb u dospělých Fetální Hb
Neglykovaný
Glykovaný
94%
- hlavní glykovaný Hb
-> 20 let využíván pro
kontrolu glykémie
5%
16
Odběr a analyzovaný materiál
• Krev (B) - odběr do EDTA
Stabilita: 2d (+20 až +25°C)
1t (+4 až +8°C)
1r (<-20°C lépe při -80°C)
18
Referenční meze
B-HbA1c 2,8-4,0 %
Kompenzace diabetu IFCC,2004 do 2004
Výborná < 4,5 % < 6,5 %
Uspokojivá 4,5 - 6,0 % 6,5 - 7,5 %
Neuspokojivá > 6,0 % > 7,5%
19
Jednotky měření (vyjadřování výsledků)
% (např. 4,5%)
mmol/mol (např.45 mmolHbA1c/mol Hb)
20
Metody stanovení
1. Referenční metody IFCC, 2002
Izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HBA1c)
Enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C)
Analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů)
a) HPLC/ESI /MS
b) HPLC/CE
c)RM DCCT
(Diabetes Control and Complication Trial, USA,v programu
NGSP=The National Glycohemoglobin Standardization
Program)
21
CRM: IRMM 466
IRMM 467
(směs čistých HbA0 a HbA1c)
Přesnost měření a nejistota
Opakovatelnost CV=1,05 %
Reprodukovatelnost CV=1,8 %
Kombinovaná standardní nejistota primárních
kalibrátorů 0,63 %
TMU (teoretická):4%
23
2. Doporučené metody:
a) Chromatografické
 HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
 LC (nízkotlaká kapalinová chromatografie)
Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová)
IEC (kapalinová chromatografie s výměnou iontů)
24
HPLC Tosoh
25
26
b) Elektroforetické
ELFO (elektroforéza)
IEF (izoelektrická fokusace)
CE a HPCE (kapilární elektroforéza)
28
c) Imunoanalytické
IT (imunoturbidimetrie)
TINIA (Turbidimetric Inhibition Immunoassay)
(Imunoinhibiční turbidimetrie)
IN (imunonefelometrie)