BC_SACHARIDY_10102009 1 Glukóza Analytická část Petr Breinek 2 Sacharidy •Monosacharidy (glukóza, fruktóza…) •Glykosidická vazba •Oligosacharidy (maltóza) •Polysacharidy (glykogen,škrob) •Diabetes mellitus •DPM 3 Laboratorní diagnostika •Glukóza •Orální glukózový toleranční test (oGTT) •Glykovaný hemoglobin (HBA1c) •Mikroalbuminurie •C-peptid •Protilátky •Inzulín 4 Požadavky na analytickou kvalitu měření FPG HbA1c Albumin v moči Glukometry Přesnost CV<2,5% CV<3,0% CV<15,0% Rozdíl od laboratorní metody: celková chyba=15% Pravdivost (bias) b <2,0% b <3,0% Návaznost metoda ID-GC/MS metoda IFCC kalibrátor CRM 470 Uc 5,0-7,0% 5 • •Nástroj laboratorní diagnózy diabetu mellitu • • • Glukóza 6 Preanalytická fáze Doporučení ČSKB, ČDS, 2005 •stanovení v plazmě žilní krve • (EDTA + NaF) •zpracování do 60 min po odběru •odběr nalačno (min. 8h lačnění) • (přiměřená hydratace,v posledních 3 dnech vyloučit fyzickou aktivitu a kouření,stravování bez restrikce sacharidů-min.150g denně) 7 •Oddělení plasmy od krevních elementů: • do 60min od odběru • •Přepočetní faktory • Je-li vzorek krve ředěn před analýzou: • FPG = 1,1 x B-Glukóza • Je-li je vzorek krve měřen bez ředění: • FPG = 0,94 x B-Glukóza 8 •Metody stanovení • 1.REFERENČNÍ metoda • ID-GC/MS • standardní přidání značené glukózy C14 (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku, následné rozdělení plynovou chromatografií a stanovení glukózy hmotnostní spektrometrií • Certifikovaný referenční materiál (CRM) • (SRM 909b NIST, SRM 917 NIST) 9 1. 2.Doporučené rutinní metody (enzymové) • a) (GOD/ PAP) glukózaoxidasa peroxidáza • •β-D-GLUKOSA + O2 + H2O ®β-D-glukonolakton +H2O2 • GOD • • • • • • • 10 • • •β-D-GLUKOSA + O2 + H2O ®β-D-glukonolakton +H2O2 • GOD • •H2O2+AAP+FENOL ® CHINONMONOIMINOVÉ barvivo + H20 • PAP (oxidační kopulace) • 11 • • b) (HK/ G6PD) • hexokináza • glukóza-6-fosfátdehydrogenáza • •GLUKOSA + ATP ® glukosa-6-fosfát + ADP • HK • • • • • • • 12 • •GLUKOSA + ATP ® glukosa-6-fosfát + ADP • HK • • •glukosa-6-fosfát + NADP+ ® glukono-6-fosfát +NADPH •G6PD • • spektrofotometricky - vzrůst absorbance NADPH při 340 nm • 13 1. • • c) (GDH) • glukózadehydrogenáza • •β-D-GLUKOSA + NAD+ ® β-D-glukonát + NADH • GDH • • • spektrofotometricky -vzrůst absorbance NADH při 340nm 14 • 3. 3.Elektrochemické metody • Clarkova kyslíková elektroda • Biosenzory s membránou se zakotvenou GOD • Glukometry (POCT) • • 15 • Kontinuální monitorování koncentrace glukózy • •Transkutánní senzory •Mikrodialýza kůže •Neinvazivní kožní a oční přístroje •Senzory pro použití na odděleních intenzivní péče 16 •Glykosurie, glukosurie = stanovení •glukózy v moči • •má jen orientační význam •prakticky byla nahrazena selfmonitoringem glykémií 17 • • Referenční rozmezí: • • S,P-Glukóza 3,9-5,6 mmol/l • CSF-Glukóza 2,8-3,9 mmol/l • dU-Glukóza 0 -1,7 mmol/24h • P-Glukóza (oGTT) nalačno 3,9-5,6 mmol/l • P-Glukóza (oGTT) po 2h 3,9-7,8 mmol/l • 18 •Klinické symptomy •P-Glu (náhodný odběr) ³11,1 mmol/l •P-Glu (nalačno) ³7,0 mmol/l •P-Glu (oGTT) po 2h ³11,1 mmol/l •Opakované vyšetření •Přesnost < 2,5% •Správnost (bias) < 2,0% DM - diagnóza 19 Glukózový toleranční test (oGTT) •Diagnóza diabetu • •Verifikace zvýšené hodnoty FPG • • BC_SACHARIDY_10102009 20 Glykovaný hemoglobin HbA1c Petr Breinek 21 Názvosloví •HbA1c •βN-1-deoxyfruktosyl hemoglobin •DOF hemoglobin • • stabilní adukt glukózy s N-terminální aminoskupinou valinu β-řetězce hemoglobinu 22 • •Nástroj sledování stavu diabetu • •Velmi dobře koreluje: vS dlouhodobým stavem koncentrace glukózy v krvi vS riziky diabetických komplikací Glykovaný hemoglobin (HbA1c) 23 Glykace proteinů * chemická vazba sacharidů na N-koncové aminokyseliny proteinů (neenzymová reakce) * in vivo- vznikají glykované (modifikované) proteiny se závažnými patobiochemickými důsledky * in vitro- hnědnutí proteinů v přítomnosti sacharidů 24 Faktory ovlivňující neenzymovou glykaci proteinů •koncentrace sacharidů a proteinů a jejich kolísání • (koncentrace proteinů v krvi relativně konstantní, rychlost glykace je úměrná koncentraci sacharidů) •doba expozice • biologický poločas daného proteinu • teplota • 25 Glykovaný hemoglobin Vzniká glykací- neenzymovým navázáním glukózy k hemoglobinu Erytrocyt Glukóza Hemoglobin 26 Hemoglobiny Hb HbA0 HbA1 HbA1a HbA1b HbA1c HbA (aaßß) HbA2 (aadd) HbF (aagg) 96% <2% 2-3% Normální Hb u dospělých Fetální Hb Neglykovaný Glykovaný 94% - hlavní glykovaný Hb -> 20 let využíván pro kontrolu glykémie 5% 27 HbA0 HbA1c Val His Leu Thr Pro Glu Gluc Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser . . . . Glu Lys Ser . . . . HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce hemoglobinu Glykována je první AK - Val ß-chain 28 Jednotky měření (vyjadřování výsledků) •% (např. 4,5%) • •mmol/mol (např.45 mmolHbA1c/mol Hb) 29 • •Návrh (IFCC-IUPAC C-NPU): • Hemoglobin beta chain(Blood)-N-(1-deoxyfructos-1-yl)hemoglobin beta chain •Jednotky: • místo % mmol/mol • 30 Odběr a analyzovaný materiál •Krev (B) - odběr do EDTA • • Stabilita: 2d (+20 až +25°C) • 1t (+4 až +8°C) 1r (<-20°C lépe při -80°C) • 31 Referenční meze • •B-HbA1c 2,8-4,0 % • Kompenzace diabetu IFCC,2004 do 2004 Výborná < 4,5 % < 6,5 % Uspokojivá 4,5 - 6,0 % 6,5 - 7,5 % Neuspokojivá > 6,0 % > 7,5% 32 Metody stanovení 1.Referenční metody IFCC, 2002 Izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HBA1c) Enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C) Analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů) a) HPLC/ESI /MS b) HPLC/CE c)RM DCCT (Diabetes Control and Complication Trial, USA,v programu NGSP=The National Glycohemoglobin Standardization Program) 33 CRM: IRMM 466 IRMM 467 (směs čistých HbA0 a HbA1c) Přesnost měření a nejistota Opakovatelnost CV=1,05 % Reprodukovatelnost CV=1,8 % Kombinovaná standardní nejistota primárních kalibrátorů 0,63 % TMU (teoretická):4% 34 •2. Doporučené metody: •a) Chromatografické vHPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) vLC (nízkotlaká kapalinová chromatografie) • • Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová) • IEC (kapalinová chromatografie s výměnou iontů) • • 35 HPLC Tosoh Tosoh_HbA1c 36 Tosoh_HbA1c_chromatogram Tosoh_HbA1c_chromatogram2 37 •b) Elektroforetické • ELFO (elektroforéza) • IEF (izoelektrická fokusace) • CE a HPCE (kapilární elektroforéza) v • • • 38 •c) Imunoanalytické • IT (imunoturbidimetrie) • TINIA (Turbidimetric Inhibition Immunoassay) • (Imunoinhibiční turbidimetrie) • IN (imunonefelometrie) • v • • • 39 •d) Spektrofotometrické • Enzymové • • v • • • 40 Enzymové stanovení HbA1c Scan0002 41 •HbA1c by měl být stanovován u nemocných minimálně 2x ročně, optimálně 4x ročně •v současnosti nejvýhodnější marker ke zhodnocení dlouhodobé kompenzace diabetu • 42 Albumin v moči - mikroalbuminurie •průkaz časné detekce diabetické nefropatie •diagnostický závěr učinit na podkladě tří opakovaných měření 43 •Materiál: • - sbíraná moč za 24h • - časovaný sběr (za 4h nebo přes noc) - náhodný vzorek (nejlépe druhá ranní moč) • •Skladování: 1 týden při +4°C 6 měsíců při -80°C 44 Vzorek Fyziologická albuminurie Mikroalbuminurie Proteinurie Sběr moči (24h) < 30 mg/d 30- 299 mg/d > 300 mg/d Náhodný vzorek < 2,8 mg/mmol kreatininu 2,8-22,8 mg/mmol kreatininu >22,8 mg/mmol kreatininu Časovaný vzorek < 20 μg/min 20-199 μg/min > 200 μg/min 45 C-peptid (connecting peptid) •Nástroj sledování stavu diabetu •Koncentrace v krvi je mírou endogenní sekrece inzulinu • (v inj. podaném inzulinu není C-peptid přítomen) • • 46 A- řetězce B-řetězce 50-75% vychytáváno játry jen 5% vychytáváno játry V krvi je poměr inzulinu a C-peptidu 1:5 47 • • Referenční rozmezí: • • S-C-peptid 0,78-1,89 μg/l • • 48 Ukazatelé autoimunity a dg.DM •ICA ( Islet Cell Antibodies, protilátky cytoplasmy T-lymfocytů) •IAA (Insulin Autoantibodies, protilátky proti inzulinu) •Anti-GAD 65A (Anti Glutamic Acid Decarboxylase, protilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové) •lA-2A, IA-2βA (Insulinoma Associated Antigens) •