BC_Kalibrace_2010
Kalibrace analytických metod
Petr Breinek
2
Měřící zařízení (zjednodušeně přístroje)
pro měření fyzikálních veličin musí být
výrobci kalibrovaná
Objem: pipety
Teplota (+37 C definovaná přesnost)
Hmotnost: váhy
Čas (?), ……
Pro účely akreditace:verifikace (ověření)
- certifikát (Český metrologický institut)
- v laboratoři
3
Měření vlastností (především koncentrace)
chemických látek a kalibrace měřících
systémů v klinických laboratořích
je obtížnější
4
Výrobci měřících systémů
• IVD MD
(in vitro diagnostic medical devices)
• zákonný předpis 98/79 EC
(reguluje výrobu, vlastnosti a prodej zařízení
vyráběných a prodávaných k posuzování
zdraví a chorob in vitro)
• označení CE = potvrzení shody vlastností
výrobku se zákonným předpisem
5
IVD MD 98/79 EC
• Týká se výrobců
• Je vyžadována návaznost hodnot
pracovních kalibrátorů a povinnost
poskytnutí dat výkonnostních charakteristik
měřících postupů, včetně postupu kalibrace
(realizace návaznosti je popsána v normách ISO
17511 a ISO 18153)
6
Validace a verifikace
Výrobci mají povinnost provádět validaci
Laboratoř musí validované metody
IVD MD 98/79 EC verifikovat (ověřovat )
Pokud laboratoř používá vlastní měřící
metody, musí je validovat (to je poměrně
velký problém)
7
Definice:
Soubor úkonů, kterými se za specifických
podmínek stanoví vztah mezi hodnotami
veličin, které jsou indikovány měřícím
přístrojem nebo měřícím systémem nebo
referenčním materiálem a odpovídajícími
hodnotami kalibrátorů
Kalibrace
8
Zjednodušeně:
Kalibrace určuje vztah mezi měřeným
signálem (např.absorbancí) a množstvím
(koncentrací) zjišťované látky (analytu).
Tento vztah je definován matematickým
modelem (kalibrační funkcí)
• Zajišťuje přenos hodnot z referenčních
materiálů/metod do rutinní laboratoře
(kalibrace je nástrojem návaznosti)
9
Kalibrátory
• Primární kalibrátory
• Certifikované referenční materiály (CRM)
• Sekundární kalibrátory
• Pracovní kalibrátory výrobce
• Kalibrátory dodávané výrobci
10
Ideální kalibrátor
• Hodnoty odvozené srovnáním s
CRM (certifikovaný referenční
materiál) nebo stanovenými
referenčními metodami
• Komutabilní (bez vlivu matrice)
• S udanou nejistotou hodnot
11
Kalibrační funkce
• Výsledkem kalibrace je kalibrační funkce
y = f(x) y…..signál
x…..koncentrace
• Grafickým znázorněním této závislosti je
kalibrační křivka
• Ze signálu potom lze vypočítat (určit)
koncentraci (množství) sledovaného
analytu
12
Kalibrační funkce
Lineární
Nelineární
Vyhodnocení:
• Manuální
• Počítačové programy
13
• Přednost se dává lineárním funkcím
(závislostem)
• Vypočítá se regresní analýzou
(statistická technika porovnání metod)
14
15
Ca = Ckal . Aa/Akal = Aa . faktor
=A/c.l
16
Rovnice lineární regresní analýzy
Y = a + b.X
Y…. signál (např.absorbance)
X…. koncentrace analytu
a…. úsek na ose y (intercept)
b…. směrnice přímky(slope)
(a…by měla být blízká nule)
17
Lineární regresní analýzou můžeme
kontrolovat (ověřovat) linearitu kalibrace
Pomáhají i metody korelační analýzy
(= metoda, která studuje vztah mezi
dvěma proměnnými hodnotami)
• Pasing-Bablokova regrese
• Demingova regrese
18
Korelační koeficient (r): statistická
charakteristika udávající těsnost vztahu
mezi dvěma proměnnými
Hodnoty: -1 ≤ r ≤ +1 minimálně r >0,985)
ideálně r = 1,0000
Koeficient determinace (r2): vyjadřuje z
jaké části lze vztah mezi dvěma
proměnnými nahradit matematickým
vztahem
21
Nelineární funkce
• Typická např. pro imunochemické metody
• Kalibrace obvykle realizována šesti
kalibrátory
• Proložení kalibrační křivky
spline
logit-log-1, logit-log-2, logit-log-3
kvadratický model
kubický model
22
23
24
25
26
Statistické (počítačové) programy
• Analyse-It®
• MedCalc ®
• CBstat®
• ADSTATLabo®
• Excel,….
Používá se parametrický (Pearson) nebo
neparametrický přístup (Spearman, Passing-
Bablok,…)
27
Počet a rozmístění kalibrátorů,
rozsah kalibrace
• dodržovat postup kalibrace výrobcem
IVD MD 98/79 EC
• počet: 1, 3 (L-M-H), 6
(při validaci 10 – 15)
• n = 1, 2, 3 (při validaci až 5)
28
• Rozsah kalibrace
(pracovní rozsah měření):
Interval koncentrací, v němž lze
dosáhnout požadované hodnoty
přesnosti a pravdivosti měření
Meze: dolní a horní mez stanovitelnosti
29
Kontrola kalibrace a
četnost kalibrací (rekalibrace)
• Analýza kontrolních materiálů
• Dodržovat doporučení výrobců
• VKK
• Kontrolní grafy (regulační diagramy)
30
Rekalibrace
- nová šarže reagencií
- doporučené údaje výrobce
- výsledky kontrolních vzorků mimo
povolené rozmezí, …
- výměna některých částí měřícího
zařízení (např. dávkovače,elektrody)
31
Nejčastější nedostatky kalibrátorů
pocházející od výrobce
• Hodnoty bez návaznosti na referenční
materiál (metody)
• Návaznost není řádně provedena a
dokumentována
• Rozdíly mezi šaržemi
• Různé hodnoty v závislosti na použité
metodě
32
Nejčastější chyby kalibrace
• Korekce kalibrace na hodnoty kontrolních
materiálů
• Používání kalibračních faktorů (údaj
výrobce) bez jejich verifikace
• Malý počet (četnost) měření kalibrátorů
• Nedostatky při práci s kalibrátory