BC-Léky_2010 1
Stanovení léků
a návykových látek
Petr Breinek
Proč se u některých léků
stanovuje jejich množství v krvi?
• Hrozí jejich toxický účinek
• Některé mají úzké terapeutické rozmezí
• Lékař pozoruje nedostatečnou terapeutickou
odpověď
• Je potřeba kontrolovat terapii
• Je podezření, že pacient léky neužívá
• Existuje dostupná metoda pro jeho stanovení
3
Terapeutické rozmezí
• Rozmezí mezi nejnižší koncentrací léku, při
které se objevuje jeho účinek a nejvyšší
koncentrací, při které se ještě neobjevuje
toxický účinek léku
Analyzovaný materiál
• Plazma
• Sérum
• Krev
• Moč
• Sliny
• Mozkomíšní mok
• Žluč nebo peritoneální tekutina
Farmakologie a laboratoř
1. Klinická farmakologie
odběr
čas odběru
interpretace výsledku
konzultační činnost
hlášení podezření na nežádoucí účinek
léku
2. Klinická biochemie
preanalytická fáze
stanovení
terapeutické rozmezí
v případě nedostupnosti klinického
farmakologa další činnosti
Odběr vzorku
• V ustáleném stavu (steady state)
• Před další dávkou („through“)
• Kdykoli („random“)
• Před a po podání („peak“)
Doba odběru musí být u každého léku
určena
+ informace o pacientovi:
renální funkce, čas podání, dávka
Obvykle monitorované léky
• Imunosupresiva (cyklosporin, takrolimus,
sirolimus, mykofenolát)
• Antiepileptika (karbamazepin, fenytoin,
kyselina valproová, fenobarbital)
• Antibiotika (gentamicin, vancomycin)
• Bronchodilancia (teofylin)
• Kardiotonika (digoxin)
• Cytostatika (metotrexát,busulfan)
V některých případech se stanovují i
metabolity léků.
TDM
terapeutické monitorování lékových hladin
• Soubor činností, jejichž cílem je
optimalizovat a individualizovat další dávky
léku
• Součástí TDM je:
- Stanovení koncentrace léčiva (příp. jeho
metabolitu) v krevním vzorku, odebraného v
definovaném časovém intervalu
- Interpretace výsledku
10
Léky jsou metabolizovány
• U stanovovaných léků je jejich
metabolizmus znám
• Přibližně u 20% osob probíhá odbourávání
léčiv jinou rychlostí, než u většiny osob
→ vzniká problém při stanovení dávky
léku
Co ovlivňuje hladinu léku ve
stanovovaném vzorku krve?
Původní látka
Vstřebávání (absorpce, distribuce)
Metabolismus (biotransformace)
Vylučování (močí, stolicí, dechem, potem)
Farmakokinetika
studuje působení organismu na lék
• změny koncentrace léku v těle
• časový průběh koncentrací léku v plasmě
Farmakodynamika
studuje působení léku na organismus
(orgány, tkáně, receptory)
• doba účinku
• stimulace
• deprese
• ovlivnění metabolismu
Farmakogenetika a
farmakogenomika
Studují individuální genetický vliv na
farmakokinetiku farmakodynamiku
• Velká interindividuální variabilita
• Cílem je individualizace volby léku a jeho dávkování
15
„Rychlí metabolizátoři“
Přeměna léku probíhá rychleji:
- nedosáhne se terapeutické rozmezí
- účinek léku se neprojevuje
- tato situace není tak nebezpečná: lékař
zvýší dávkování léku
16
„Pomalí metabolizátoři“
Přeměna léku probíhá pomaleji:
- množství léku v krvi přesahuje
terapeutické rozmezí, i když užívá
doporučené dávky
- často dochází k toxickým projevům až k
poškození organismu
- závažnější stav
17
Co to způsobuje?
• dlouhou dobu se to nevědělo:
lék se vysadil nebo změnil
• u pomalých metabolizátorů je to často
zapříčiněno geneticky:
vrozené ,,chybění‘‘ nebo změněná funkce
některého enzymu (např. CYP450 se
podílí na metabolismu asi 30%
používaných léků
18
Současná praxe
• Sleduje se koncentrace léku v krvi
• Pacient musí chodit na kontroly (odběry
krve)
• V případě problémů se upraví dávkování,
či změní lék..
19
Budoucnost
Začíná se sledovat:
• buď vrozené chybění
• nebo změněná forma příslušného enzymu
(vedoucí k pomalé přeměně léku v
organismu)
20
Metody stanovení
1. Chromatografické metody
HPLC
HPLC/MS
LC/MS
GC/MS
TLC
21
Techniky úpravy vzorků:
• Extrakce kapalinou
• Extrakce pevnou látkou (SPE)
• Ultrafiltrace
• Derivatizace
• Extrakce plynem (headspace)
• Adsorpce
• Vymrazování
22
HPLC – jednoduché schéma
Eluční činidlo
Pumpa
Nanesení
vzorku Kolona
Detektor
Odpad
Převodník
signálu
Zapisovač
23
HPLC
24
2. Imunoanalytické metody
a) fluorescenční imunoanalýza (FIA,
FPIA, DELFIA)
b) enzymová imunoanalýza (EMIT,
ELISA, MEIA,CEDIA)
c) luminiscenční imunoanalýza (LIA,
ILMA, CMIA, ECLIA,…
25
3. Metody pro odhalování genetického
polymorfismu v metabolismu léčiv
Lze stanovit:
a) Fenotyp (rychlost transformace)
b) Genotyp (analýza DNA, DNA čipy)
26
TACROLIMUS
• Imunosupresivum, FK 506
• obchodní název PROGRAF®
• objev (1984): extrakt z houby
(Streptomyces tsukubaensis) japonská
farmaceutická firma Fujisawa (kódové č.
FK 506)
• přispívá významnou měrou k dosažení
současného stupně rozvoje transplantace
orgánů a buněk, používá se také při léčbě
závažných autoimunitních onemocnění
27
• je 10x až 100x účinnější ve srovnání s
cyklosporinem
• působí inhibičně v časné fázi aktivačního
procesu T lymfocytů
• metabolizuje se v mikrosomech jaterních
buněk (cytochrom P450)
• existují i závažné nežádoucí účinky
(hypertenze, nefrotoxicita,neuropatie,
hepatopatie, hyperlipoproteinemie)
• z toho vyplývá nutnost laboratorního
monitorování lékové terapie (TDM)
28
Analyzovaný materiál
• pouze krev (EDTA)
• stabilita
+2 až +8 C …………14 dní
≤ -70 C ……………. 2 měsíce
koncentrace v krvi je průměrně 35x vyšší
(12-67x) než v plazmě
29
CYKLOSPORIN A
MYKOFENOLOVÁ KYSELINA
• Imunosupresiva
• Odběr: nesrážlivá krev (EDTA)
• Referenční meze: podle doby po
transplantaci a druhu transplantace
• Cy A: cyklický polypeptid
• MPA: aktivní část z léčiva mofetil
30
DIGOXIN
• Odběr: srážlivá krev
před podáním nebo 6-11 h po
podání
• Referenční meze: 0,5-1,2 ug/l
• Srdeční glykosid, je indikován při srdečním
selhávání
• DLIF (digoxin-like immunoreactive factor)
• DLIS (digoxin-like immunoreactive substance)
31
LITHIUM
• Odběr: srážlivá krev
10-18h po podáním
• Terapeutická hladina: 0,5-1,2 mmol/l
• Profylaxe maniodepresivního onemocnění
• Stanovení: nejčastěji PES(plamenová emisní
spektrometrie)
32
Toxikologie a návykové drogy
33
Vyšetřované skupiny návykových látek
–Amfetaminy
–Benzodiazepiny
–Kanabinoidy
–Kokain
–Opiáty
(Psilocin a psilocybin - halucinogenní houby)
Fencylidin (CP)
LSD
Zákon 167/1998 Sb.
O návykových látkách;Seznam omamných a psychotropních látek
Alkohol (etanol)
• Plynová chromatografie (GC)
• Widmarkova zkouška
• Enzymové metody
• Imunoanalytické metody
Enzymové stanovení
Oxidace etanolu pomocí alkoholdehydrogenázy
C2H5OH + NAD+ = CH3CHO + NADH+H+ (AlDH)
Etanol Acetaldehyd
Widmarkova zkouška
nespecifická - volumetrické stanovení všech
redukujících látek založené na jodometrické
oxidačně-redukční titraci:
3CH3CH2OH + 2Cr2O7
2- + 16H+ = 3CH3COOH + 4Cr3+ + 11H2O
Cr2O7
2- + 6I- + 14H+ = 2Cr3+ + 3I2 + 7H2O
I2 + 2S2O3
2- = 2I- + S4O6
2-
37
Metamfetamin (Pervitin)
Amfetamin
Methylenedioxymetamfetamin (MDMA, Extáze)
Efedrin
Fenmetrazin, Fentermin
• Cut-off: 1000 ng/ml
• Doba záchytu v moči: MA a metabolity 3 až 5d po ukončení aplikace
• Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS
Amfetaminy
38
Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam,
Diazepam, Flunitrazepam, atd.
• Cut-off: 300 ng/ml (↓)
• Doba záchytu v moči: 1 až 7d
• Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS (?)
Benzodiazepiny (BZD)
39
delta-9-tetrahydrokanabinol (THC)
Cannabinol (CAN)
Cannabidiol (THC-COOH)
• Cut-off: 50 ng/ml
• Doba záchytu v moči: 1 až 3d po jednorázové dávce;
až 30d u chronických uživatelů
• Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS
Kanabinoidy (obsažené v marihuaně)
40
Kokain
Crack (volá báze kokainu)
• Cut-off: 300 ng/ml
• Doba záchytu v moči: 3 až 6h; 24-6h metabolity;
až 5d u chronických uživatelů
• Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS
Kokain
41
Morfin
Heroin (diacetylmorfin)
Braun (hydrokodon)
Kodein
Ethylmorfin
Dihydrokodein, …
• Cut-off: 300 ng/ml (morfin)
• Doba záchytu v moči: až 3d po poslední dávce
• Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS
Opiáty
42
Metody stanovení
1. Chromatografické metody
HPLC
HPLC/MS
LC/MS
GC/MS
TLC
43
Kazetový test
(pozitivní na amfetaminy)
44
GC–TRACE GC MS – POLARISQ (Finnigan)
45
2. Imunoanalytické metody
a) fluorescenční imunoanalýza (FIA,
FPIA, DELFIA)
b) enzymová imunoanalýza (EMIT,
ELISA, MEIA,CEDIA)
c) luminiscenční imunoanalýza (LIA,
ILMA, CMIA, ECLIA,…