Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 10: Úvod do sérologie, aglutinace, precipitace a komplementfixace; ředění séra Ondřej Zahradníček 777 031 969 zahradnicek@fnusa.cz ICQ 242-234-100 Úvodem nV této přednášce se už zase budeme zabývat mikrobiologickou diagnostikou, přičemž využijeme to, co jsme se dozvěděli v minulé přednášce. Nejvíc si pamatujme to, co jsme se dozvěděli o specifické humorální imunitě: je založena na interakci antigenu (v případě mikrobiálních antigenů jde o povrchovou část těla mikroba) s.protilátkou (imunoglobulinem, který je tvořen makroorganismem. Pro zopakování: Metody lékařské mikrobiologie nPřímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. nNepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky) Antigen a protilátka - opakování nAntigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli antigenní odpověď nProtilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele jako odpověď na antigenní výzvu (samozřejmě nejen u.člověka, ale i u zvířat) Dva způsoby, jak to využít: Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Průkaz antigenu a antigenní analýza nV rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy: nPřímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku nAntigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) nU nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky Interpretace nPrůkaz antigenu (včetně antigenní analýzy) je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta nPrůkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: nMnožství protilátek (relativní – titr) nTřída protilátek: IgM/IgG (více v další přednášce) n(Avidita protilátek) Jak tyto informace zjistit nAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM nPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) nChronická infekce: různé možnosti IgM a IgG 1 1 2 2 Jak provést reakci „kvantitativně“ nJe velmi těžké zjistit koncentraci protilátek v jednotkách mol/l, mg/l apod. nAle dá se dělat jiná věc: mnohonásobně ředit pacientovo sérum. nReaguje-li i po mnohonásobném ředění à à v séru je velké množství protilátky nReaguje jen při nevelkém zředění séra à à jen malé množství protilátky Geometrická řada nTechnicky nejjednodušší způsob, jak ředit sérum pacienta, je použití geometrické řady s koeficientem dva. nVycházíme z neředěného séra, nebo ze séra o určitém předředění (např. 1 : 5, 1.:.10, 1 : 20 a podobně) nV každém dalším důlku je dvojnásobné ředění oproti předchozímu, například tedy řada 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160… Počítání ředění v serologii nPozor, v serologii např. ředění 1 : 4 znamená jeden díl séra a tři díly fyziologického roztoku (tj. čtyři díly celkem)! nPři „biochemickém“ počítání (počet dílů séra ku počtu dílů diluentu) bychom naše geometrické řady museli značit např. 1 : 9, 1 : 19, 1 : 39, 1 : 79. To by bylo značně nepraktické Geometrická řada: jak ji udělat a) bez předředění původního séra C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Geometrická řada.bmp b) s předředěním původního séra nSamozřejmě, předředění nemusí být zrovna 1 : 100, může to být třeba 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 či jakékoli jiné. C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Geometrická řada 2.bmp Poté, co se provede naředění… nPo naředění séra geometrickou řadou se do všech zkumavek nebo důlků přidá antigen. Nyní v každém důlku buď dojde, nebo nedojde k reakci; to může být vidět, nebo se to musí zviditelnit přidáním další složky nSledujeme, jak moc můžeme sérum naředit, aby ještě byla viditelná (respektive „zviditelnitelná“) pozitivní reakce Pojem TITR Titry Titr – nejvyšší ředění, kde je ještě viditelná pozitivní reakce. I pokud jsme reakci pro zpřesnění provedli ve dvou řádcích místo jednoho (s různým počátečním předředění), určí se jen jeden titr. Titry •Při použití geometrické řady znamená •vzestup/pokles titru o jeden důlek dvojnásobný vzestup pokles. •vzestup/pokles o n důlků je pak vzestup/pokles 2nnásobný. Vzestupy a poklesy titru Proč nestačí samotný titr nNěkdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v.akutní fázi titr dosti nízký Dva pacienti Velmi reaktivní pacient má naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký Párová a nepárová séra nPárová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý. Pak jsou oba hodnoceny naráz. Čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Bohužel párová séra nejsou běžná. nSéra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup titru. Tyto údaje jsou však pouze orientační a liší se případ od případu. Pořád musíte mít na paměti: nVeškeré „srandičky“ typu titry, třídy protilátek, zjišťování avidity, slouží k.odlišení akutní infekce, chronické infekce a stavu po dávno prodělané infekci. Týkají se ovšem pouze nepřímého průkazu! nPřímý průkaz totiž přímo prokazuje v těle pacienta část patogenova organismu. Není tedy nutné žádné další upřesnění Jednotlivé serologické reakce nExistuje několik typů serologických reakcí. Některé jsou jednoduché, výsledek reakce antigenu s protilátkou je přímo viditelný, jiné jsou složité, je nutné přidání dalších složek nTéměř všechny mohou být použity k průkazu antigenu, k antigenní analýze i k průkazu protilátky; ne všechny se ale ke všem těmto účelům doopravdy používají nV rámci reakcí existují ještě často různé možnosti technického provedení Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Průkaz antigenu Antigenní analýza Nepřímý průkaz Aglutinace občas často někdy Precipitace málokdy málokdy občas KFR často (viry) ne často (viry) Neutralizace občas ne často Značené složky velmi často výjimečně velmi často Precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích nPrecipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolekul (koloidní antigen) nAglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby) nAglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza) Precipitace Precipitace Využití precipitace nPrecipitace je stará reakce, která už se dnes využívá poměrně málo. Několik případů využití však zůstává: nV nepřímém průkazu: nReakce RRR u syfilis (zvláštní je tím, že je to reakce s tzv. heterofilním antigenem, tedy že antigen nepochází z mikroba) nMikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho (u aspergilózy, dříve i u toxoplasmózy) nV přímém průkazu se kdysi používala prstencová precipitace u streptokoků RRR jako příklad precipitace nDetekce protilátek, které jsou pozitivní u syfilis, ačkoli to nejsou protilátky proti Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu (látka, která se objevuje u syfilitiků v těle, ale může se objevovat i při některých jiných stavech) nTakovým reakcím říkáme průkaz heterofilních protilátek – jsou to tedy protilátky, které nejsou zaměřené proti antigenu mikroba, ale proti jinému antigenu, který je v době výskytu mikroba přítomen v.těle pacienta. nReakce je poměrně dost citlivá, ale velmi málo specifická (pozitivita se musí ověřit jinými, spolehlivějšími metodami) Mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho nV prostředním důlku je suspenze antigenu. Do čtyř ostatních důlku se dají séra pacientů. Antigen difunduje ze svého prostředního důlku do okolí. Je-li sérum pozitivní, difundují z něj protilátka. Uprostřed cesty se antigen s protilátkou setká a vznikne precipitační linie. ouchterlony + - - - Prstencová precipitace nPrecipitace k detekci antigenu: n1) zvířecí sérum s protilátkami se napipetuje do pipetky zabodnuté do plastelíny n2) čtyři různé extrakty kmenů se opatrně převrství na séra (aby se nesmíchaly) n3) při pozitivitě se na styku tekutin objeví prstenec – důkaz precipitace Prstencová Aglutinace Aglutinace Aglutinace: příklady použití nK antigenní analýze: nurčení serotypu u střevních patogenů, zejména salmonel, shigel a yersinií nurčení některých serotypů Escherichia coli ntechnické provedení: smíchání kmene (nebo jeho suspenze ve fyziologickém roztoku) s příslušným sérem nK přímému průkazu ve vzorku se používá spíše aglutinace na nosičích (viz dále) nK nepřímému průkazu různých bakterií (u yersinií, tularémie ntechnické provedení: v mikrotitrační destičce s využitím ředěných sér pacienta Příklad antigenní analýzy pomocí aglutinace: Průkaz Enteropatogenní Escherichia coli nVětšina kmenů Escherichia coli je „hodných“ nZe všech antigenních typů E. coli je asi 12, které jsou „enteropatogenní“ (EPEC) – mohou dělat novorozenecké průjmy. Neliší se nijak jinak než svými antigeny. Máme-li tedy kmen E. coli ze stolice novorozence, je vhodné ověřit antigenní analýzou, zda nejde o kmen EPEC. nTest probíhá jako smíchání suspenze podezřelého kmene s protilátkami. Dvě kapky se smíchají na sklíčku. Pozitivita se projeví jako vznik vloček v kapce Použití polyvalentních sér nPříklad průkazu EPEC je zároveň ukázkou využití tzv. polyvalentních sér. nVzhledem k tomu, že antigenních typů E. coli řazených k EPEC je asi 12, bylo by normálně nutno provést 12 testů s různými protilátkami. nV praxi ale použijeme polyvalentní séra: nonavalentní obsahuje protilátky proti devíti typům EPEC, trivalentní proti dalším třem. nJe vám jasné, proč tu neurčujeme titry? (Je to samozřejmě proto, že jde o antigenní analýzu a ne průkaz protilátek) Průkaz EPEC – výsledek Clumping faktor Aglutinace na průkaz protilátek se obvykle provádí v mikrotitrační destičce. Jak vypadají pozitivní a negativní výsledky? nPozitivní – nepravidelný chuchvalec (aglutinát) nnegativní – malé pravidelné kolečko (neaglutinované bakterie sedimentují na dno) Aglutinace Nezapomeňte, že titr = nejvyšší ředění s pozitivní reakcí. První důlek je ředěn 1 : 2, druhý 1 : 4 atd. Příklad výsledku: aglutinace k detekci protilátek proti yersiniím nK+ pozitivní, titr = 1 : 200 nČ. 1 negativní nČ. 2 pozitivní, tit. = 1 : 400 nČ. 3 negativní nČ. 4 pozitivní, titr = 1 : 200 1:100 1:200 1:400 1:800 Konkrétní ukázka (ono se to špatně fotografuje, lépe je to vidět při reálním pozorování, i tak je potřeba pozorovat proti černému pozadí) Tularemie detail V prvním sloupci jsou kontroly, vlastní reakce začíná od druhého sloupce 1:2 1:4 1:8 www.medmicro.info Aglutinace na nosičích Aglutinace na nosičích Aglutinace na nosičích nJak již bylo řečeno, je to vlastně precipitace převedená na aglutinaci použitím nosiče (červená krvinka, latexová či polycelulózová částice). nPoužíváme ji tam, kde pracujeme s koloidním (makromolekulárním) antigenem, případně když si nejsme jisti, jestli budeme mít k dispozici celé bakterie (zejména u přímého průkazu ve vzorku) Aglutinace na nosičích – využití nPřímý průkaz ve vzorku nprůkaz antigenů bakterií, které mohou způsobovat záněty mozkových blan, přímo ve vzorku mozkomíšního moku nAntigenní analýza s kmeny bakterií nskupinové určení streptokoků nurčení antigenního typu u Haemophilus influenzae nurčení seroskupiny meningokoků na spousta dalších podobných případů nK nepřímému průkazu méně často, příkladem je reakce TPHA k průkazu protilátek u syfilis Aglutinace na nosičích Treponema pallidum hemaglutinace (TPHA) k průkazu syfilis nPoužijeme červené krvinky, na které je teprve navázán vlastní antigen T. pallidum (Dnes se v tomto testu červené krvinky nahrazují polycelulózovými částicemi – v tom případě jde o TPPA (T. p. polyceluózová aglutinace) nTato reakce je sice nepřímý průkaz, ale nepoužívá se ředění a nezjišťují titry. Je to totiž tzv. screeningová reakce a případná pozitivita se dále ověřuje spolehlivějšími metodami Ukázka výsledku TPHA nV horním řádku jsou pozitivní kontroly od vysoce pozitivní (+++) po hraniční (+/-) nVe druhém řádku jsou negativní kontroly nVýsledky se odečítají v dalších řádcích, vždy ve čtvrtém sloupci. Pacienti 1, 2 i 3 jsou negativní. TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - Komplementfixace: srovnání s ostatními nU precipitace potřebujeme do reakce jen samotný antigen (makromolekulu) a protilátku nU aglutinace do reakce vstupuje zpravidla celá bakterie, antigen je její součástí nU aglutinace na nosičích máme kromě antigenu a protilátky v reakci ještě nosič antigenu (krvinka, latex, polycelulóza) nU komplementfixace máme v reakci navíc komplement a indikátorový systém (amboceptor a beraní erytrocyty) Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Průkaz antigenu Antigenní analýza Nepřímý průkaz Aglutinace občas často někdy Precipitace málokdy málokdy občas KFR často (viry) ne často (viry) Neutralizace občas ne často Značené složky velmi často výjimečně velmi často Komplementfixace (KFR) nKomplement = složka imunitní reakce nPotřebujeme pracovat s přesně odměřeným množstvím komplementu, proto pacientův vlastní komplement před reakcí inaktivujeme a do reakce používáme komplement morčecí nKomplement není schopen vázat se na samotný antigen nKomplement není schopen vázat se na samotnou protilátku nKomplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou nsoučást nespecifické humorální imunity nsložitý kaskádový systém C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\KFR\02 komplement.bmp http://img.tfd.com/dorland/thumbs/complement.jpg Komplement Komplement – na co se váže: nKOMPLEMENT + POUHÝ ANTIGEN: neváže se nKOPMLEMENT + PROTILÁTKA: neváže se nKOMPLEMENT + KOMPEX ANTIGENU S PROTILÁTKOU: vazba Princip komplementfixace nKomplement se tedy váže na komplex antigen-protilátka (nezůstává žádný volný komplement) To ale samo o sobě není vidět. nProto používáme ještě tzv. indikátorový komplex – beraní erytrocyty + králičí protilátky proti nim (tzv. amboceptor). V případě, že se na zbyl volný komplement, naváže se na indikátorový systém a dojde k hemolýze Pokus k ověření funkce komplementu (dělají medici v praktiku) nAmboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům 1.Beraní ery + amboceptor bez komplementu à není hemolýza (chybí komplement) 2.Beraní ery + komplement bez amboceptoru à není hemolýza (chybí protilátky) 3.Beraní ery + komplement + amboceptor à hemolýza (všechny složky přítomné) 4.Králičí ery + komplement + amboceptor à není hemolýza (chybí „ten správný“ antigen) Princip KFR (negativní, pozitivní) KFR Problémy s KFR nPříliš mnoho komplementu à falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement (viz další obrazovka) nNěkterá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity. Je to vlastně „skoro normálně“ provedená reakce, ovšem bez antigenu Titrace komplementu nPro reakci potřebujeme množství morčecího komplementu, které není moc velké ani malé. nProto zjišťujeme, jaké množství komplementu hemolyzuje pracovní jednotku krvinek s.amboceptorem (hemolytická jednotka) Test antikomplementarity KFR antikomplementarita Použití KFR nKFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí nJako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky nČastější je ale průkaz protilátky, proto se jím budeme zabývat víc nBerme to tedy tak, že máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky) Praktické provedení KFR nKFR se zpravidla provádí v mikrotitrační destičce. nU průkazu protilátek se zpravidla postupuje následovně: npacient má celý řádek (u párových sér dva řádky – jeden na první, druhý na druhý vzorek) nv prvním důlku (nalevo od čáry) je test antikomplementarity (musí být hemolýza, jinak nutno opakovat) nv dalších důlcích (napravo od čáry) je vlastní test s různě ředěnými séry nU vlastních testů (napravo od čáry) platí: tečka = pozitivita, hemolýza = negativní Ukázka výsledku KFR nNalevo od čáry jsou testy antikomplementarity. nPředředění séra je 1:10, další důlky mají ředění 1:20, 1:40 atd. nPozitivní je pacient 1 (titr 1 : 80), a pacienti 2, 3, 4, 6, 7 (titr 1 : 20, u 3 a 4 možná 1 : 40) nOstatní pacienti jsou negativní (nemají protilátky proti toxoplasmóze) D:\Atlas (F)\atlas\serology\kfr\kfr.jpg Pro dnešek děkuji za pozornost C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Profesor Tomášek\ProfTo00.jpg Prof. Tomášek, někdejší přednosta našeho ústavu, objevitel tzv. Tomáškova antigenu u syfilis