Mikrocytogenetika Prenatální diagnostika VCA Renata Gaillyová LF MU 2010 Mikrocytogenetika Molekulární cytogenetika •FISH (fluorescenční in situ hybridizace), M-FISH, SKY (spektrální karyotypování), CGH (komparativní genomová hynridizace), MLPA •submikroskopické změny (mikrodelece nebo mikroduplikace, marker chromosomy, složité přestavby, vyhledávání typických změn v onkologii…) •rychlá diagnostika v časové tísni, v graviditě •vyšetření v metafázi i interfázi • spojení poznatků molekulární biologie a cytogenetiky • doplňuje, zpřesňuje a urychluje cytogenetické vyšetření • řeší nedostatky klasické cytogenetiky: • nedostatečný počet mitóz • špatná kvalita chromozomů • nízká citlivost vyšetření FISH Komparativní genomová hybridizace 8dobr1 pokus88d MLPA •Multiplex ligation-dependent Probe Amplification •Multiplex gene dosage analysis made easy” Poprvé popsána: Schouten JP et al. (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. Jun 15;30(12):e57. •Metoda využívaná na OLG od roku 2006 •Doplňuje a rozšiřuje spektrum metod využívaných v molekulární genetice a molekulární cytogenetice MLPA •detekce aberantních DNA sekvencí – převážně delecí a duplikací celých exonů genů •jednoduché provedení na základě PCR reakce •minimum pouze 20 ng DNA •lze analyzovat degradovanou DNA •diskriminuje sekvence lišící se pouze v jednom nukleotidu •determinuje metylační status promotrů •detekce známých mutací a SNP MLPA spektrum vyšetření na OLG FN Brno •Mikrodeleční syndromy •Syndrom Di George (22q11,10p15,4q34,8p23,9q34,17p13) •Přestavby subtelomerických oblastí • • Klinické znaky pro selekci pacientů Body Růstové anomálie postnat.–mikro/makrocephalie max 1 bod Růstové anomálie postnat.–malá/vysoká postava max 1 bod Faciální dysmorfie max 2 body Drobné atypie rukou a nohou max 2 body Velké vrozené vývojové vady max 2 body Dysproporcionální postava max 2 body Celkem Syndrom Di George •Velo - Kardio- Faciální syndrom •CATCH 22 •Vrozené srdeční vady typické konotrunkální vady, faciální dysmorfie, hypoplasie - aplasie thymu event. příštitných tělísek, imunodefekty, hypoparathyreoidismus •(22q11,10p15,4q34,8p23,9q34,17p13) • Williams - Beuren syndrom •del 7q11.23 • •Faciální dysmorfie - Elfin face – silné rty, odstávající větší uši, srdeční vady - stenosy aorty, plicnice, hypokalcemie, malá postava, PMR, hernie, hrubý hlas, kostní anomalie, přátelská povaha, dobrý sluch... Prader-Willi syndrom •Hypotonie, hypotrofie, poruchy příjmu potravy v kojeneckém věku • •PMR, malá postava, obesita, hyperfagie, akromikrie, hypogonadismus později • •mikrodele delece 15q11-12 paternální • Prader-Willi syndrom •Snížená aktivita plodu §Neprospívání kojenců § Hypotonie novorozenců §Obesita §Hyperfagie, neukojitelný hlad §Hypogenitalismus, hypogonadismus §PMR §Malá postava §Akromikrie §Hypopigmentace §Problémy s chováním • Angelman syndrom •těžká PMR, epilepsie, záchvaty smíchu, těžce opožděn vývoj řeči •atypické chování •stigmatizace •mikrodelece 15q11-12 mat Telomery •fyzické konce chromozomů •úplné konce tvořeny proteiny a tandemovými repeticemi DNA(TTAGGG) 3-20 Kb • (společné pro všechny chromozomy) •TAR – doprovodné repetitivní sekvence subteloerické oblasti 100-300 Kb •jedinečné sekvence – sondy pro FISH, MLPA, HR-CGH • • • Klinický význam přestaveb telomer •aberace v této oblasti - příčina spontánních abortů, VVV a mentálních retardací • •6-8 % pacientů s dysmorfií a MR - mikrodelece subtelomerických oblastí chromozomů !!! • • • Prenatální diagnostika VCA •Screeningové vyšetření (celoplošné) •biochemický screening I. trimestru, •biochemický screening II. trimestru •integrovaný a kombinovaný screening •screening UZ • •Vyšetření cílené (invazivní) •CVS •AMC •Kordocentéza •Specializovaný UZ • • • • • • • o - • Biochemický screening •Biochemický screening I. trimestru •v 10.-12. týdnu těhotenství (t.g.) •Biochemický screening II. trimestru •16-18. týdnu těhotesntví • •Vyhledávání těhotenství se zvýšeným rizikem Downova syndromu, Edwardsova syndromu, rozštěpu neurální trubice nebo Smith-Lemli-Opitzova syndromu u plodu • •Vyšetření dobrovolné – doporučené všem těhotným, hodnotí specialista Screenin I. trimestr •10.-13.t.g. dle UZ •PAPP-A, free beta hCG •UZ – nuchální projasnění (NT v mm) •UZ - přítomnost-osifikace nosní kůstky (NB+/-, event. další UZ markery) •Riziko M. Down (+21) •Výpočet individuálního rizika pro těhotenství • •Hodnotí specialista • • BCH screening - II. trimestr Downův syndrom •Počítačové vyhodnocení- individuální riziko •Positivní: 1/250 a méně •Hraniční: 1/250 – 1/350 • •Kombinovaný, integrovaný screening AFP (snížení) pod 0,5 MOM HCG (zvýšení) nad 2,0 MOM uE3 (snížení) pod 0,6 MOM BCH screening II. trim. Syndrom Edwards •AFP – snížen •HCG – snížen •uE3 - snížen • •Počítačové vyhodnocení – ind. riziko!!! • •UZ – hypotrofie, VVV, atypické držení prstů, atypický profil obličeje…. Jiné chromosomové aberace •zvýšená hodnota hCG ??? • •patologie při UZ specializovaném vyšetření • •atypický screening • •Screening hodnotí vždy specialista • •Nespolehlivé a nespecifické • • • Prenatální biochemický screening • •Hodnotí se počítačový výsledek •Individuální riziko •Zvýšené riziko = doporučení genetické konzultace • a dalšího upřesňujícího • vyšetření •ultrazvuk •odběr CVS, plodové vody – karyotyp… UZ screening •10-13.t.g. - délka těhotenství, počet plodů, srdeční akce, základní anatomie plodu •projasnění na krčku plodu (NT), přítomnost nosní kůstky NB+/- k hodnocení riziko Downova syndromu u plodu a další •20.t.g. – poznatelné vrozené vývojové vady a nepřímé známky VCA, velikost plodu, množství plodové vody, srdeční akce •21.t.g. – vrozené srdeční vady • •Vyšetření by měl vždy provádět specialista • • • Prenatální kardiologie ve 21.t.g. (detekce poznatelných srdečních vad) •Vrozené srdeční vady jsou nejčastější vývojovou vadou u člověka, často spojené s dalším postižením •Prenatální diagnostika srdečních vad vyžaduje specializovanou erudici a zkušenost •Poznání srdeční vady u plodu umožňuje dle závažnosti modifikovat další postup (ukončení těhotenství, léčba plodu, sledování a porod na specializovaném pracovišti) • • Invazivní postupy •CVS – odběr choriových klků – od 11.t.g. • •AMC – odběr plodové vody •Časná AMC – 12-14.t.g. – málo, vyšší rizika •Klasická AMC 15-18.t.g. •Pozdní AMC • •Kordocenteza – odběr fetální krve z pupečníku •Placentocenteza Důvody k odběru plodové vody •Positivní biochemický screening •Patologický ultrazvukový nález u plodu •Nosičství balancované chromosomové aberace u rodičů •Chromosomová aberace v rodině •(Vyšší věk rodičů – relativní indikace) •Monogenně dědičné • nemocnění v rodině • Preimplantační genetická diagnostika (PGD) •Jedná se o časnou prenatální diagnostiku, která je vázaná na techniky umělého oplodnění. • •PGD je metoda umožňující genetickým vyšetřením jedné nebo dvou buněk (blastomer) odebraných z vyvíjejícího se embrya odhalit genetické abnormality budoucího plodu. K transferu do dělohy lze vybrat pouze embrya bez genetické zátěže. • •Před provedením PGD doporučujeme prekoncepční genetické vyšetření a stanovení karyotypu partnerů, DNA analýza rodičů při monogenně dědičném onemocnění. • Preimplantační genetická diagnostika v.s. preimpalntační genetický screening častých aneuploidií •PG Diagnostika – vyšetření u párů s vysokým genetickým rizikem onemocnění u plodu •Strukturní chrom. aberace •Monogenně dědičná onemocnění •PG Screening – screening nejčastějších aneuploidií, riziko je zvýšené vzhledem k věku nebo nepříznivé reprodukční anamnese Preimplantační genetický screening nejčastěších aneuploidií Nejčastěji vyšetřované chromosomy •13,15,16,18,21,22,X, Y • •příčiny nejčastějších aneuploidií •příčiny spontánních potratů Výhody PGD •detekce genetických změn v nejrannějším stádiu prenatálního vývoje •zvýšení pravděpodobnosti úspěšného transferu a tím i úspěšné gravidit •snížení rizika spontánního potratu výběrem embrya bez chromozomové aberace •snížení potřeby ukončení gravidity z genetické indikace •snížení psychické zátěže pro rodiče Nevýhody PGD •nutnost IVF (i u plodných párů) •časová tíseň •finanční náročnost metody •možno provádět pouze malé množství materiálu •(dg. z 1 - 2 buněk) •větší riziko diagnostického omylu prenatální diagnostiky •neodhalení případného mozaicizmu !! •nutno doporučit vždy kontrolu klasickými metodami •etické hledisko • Etické a právní aspekty prenatální diagnostiky •vyšetření dobrovolné •vždy dle přání rodiny •dle platných zákonů •genetické poradenství •nedirektivní přístup •snaha o maximální informovanost rodiny