PRAKTIKUM č.2
ÚKIA, LF MU, Mgr. Olga TICHÁ


PROTILÁTKY
• protilátky jako základní reagens při imunologických metodách

• základní charakteristika reakce Ag – Ab

Obecné principy reakce Ag - Ab
        Antigen – látka schopná vyvolat imunitní reakci

vazebné místo: EPITOP (antigenní determinanta)
Protilátky
vazebné místo: PARATOP
AFINITA (epitop s paratopem)   a   AVIDITA
nativní
rekombinantní
monoklonální
polyklonální

PROTILÁTKY (Ab)
Fab
Fc

Rozeznání Fc Ab makrofágem



TŘÍDA PROTILÁTEK
•dle typu konstantního řetězce


Interakce volného Ag s volnými Ab



AFINITA
•vazba Ag-Ab zahrnuje vodíkové můstky, iontové vazby, hydrofóbní interakce, van der Waalsovy síly
•dána velikostí síly mezi jedním vazebným místem Ab a jedním epitopem Ag
Afinita

AVIDITA
•dána vícenásobnou interakcí mezi multivalentní Ab a Ag (opakovaný epitop na povrchu)


•POZOR!
•Antigenem může být i protilátka!!!


PŘÍPRAVA MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK I.
Příprava MP-I


MAb II.
•
Příprava MP-2

•
Příprava MP-III
MAb III.

Příprava MP-IV
MAb IV.


•
MAb


MAb
POUŽÍVANÉ K TERAPII
•Myší (celé) -momab
•Chimérické (myší VH VL  ) -ximab
•Humanizované (myší hypervar.úseky) -zumab
•Lidské (připravené technikami mol.biol. dle knihoven)

Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob
•Imunosuprese:
• -   anti-CD3 (OKT3),
–anti CD25 (basiliximab, daclizumab),
–anti CD20 (rituximab)
•Blokáda prozánětlivých cytokinů:
–Anti –TNF-a (infliximab, adalimumab) – revmatoidní artritida, Crohnova choroba,
•Blokáda adhezivních molekul:
–anti integrin a4b1 (natalizumab) – roztroušená mozkomíšní skleróza
–Anti-CD11a (efalizumab) - psoriáza
•Protialergická léčba
–anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu

Monoklonální protilátky v humánní medicíně
•Transplantologie
    Muronomab-CD3 , Basiliximab (IL2r alfa, chim.),
    Daclizumab (IL2r alfa, hum.)
•Kardiologie
    Abciximab (glykoprotein IIb a IIIa trombocytů, chim.)
•Revmatologie
    Infliximab (TNFalfa, chim.) Adalimumab (TNFalfa, lidská)
•Gastroenterologie
    Infliximab (TNFalfa, chim.)
•Infekční lékařství
    Palivizumab (F-protein RSV, hum.)
•Neurologie
    Natalizumab (inhibitor adhesivní molekuly a4 b1) - SM

Monoklonální protilátky v humánní medicíně
•Onkologie
    Trastuzumab (HER2 onkoprotein, hum.), ca mammae
    Cetuximab (epithelial growth factor receptor EGFR1,
    chim.), Edrecolomab (epithelial cell adhesion molecule,
    myší) kolorektální ca
•Hematoonkologie
    Rituximab (CD20 na B-lymfocytech, chim.) nehodgkinský lymfom, CLL
    Alemtuzumab (CD52 na B,T,NK,mono, hum.) CLL
•Alergologie
   Omalizumab (humanisovaná anti IgE)

Produkce antigenů a protilátek
v transgenních rostlinách
•Rekombinantní protilátky
       SIgA/G Streptococcus mutans (tabák)
       IgG HSV2glykoprotein B ( sója)
       scFv-bryodin 1 imunotoxin CD40
       (tabák,bun.susp.)
•Rekombinantní podjednotkové vakcíny
       HBsAg  (tabák)
       Glykoprotein viru vztekliny (rajče)
       Termolabilní enterotoxin E.coli (tabák, brambory)
       Virus prasečí gastroenteritidy (tabák, kukuřice)
(Ma KCJ et al.: Nature Rev Genetics 2003; 4: 794-805)

CVIČENÍ Č.1
•Úkol č.1: ředění geometrickou řadou
• (řady 1,2)
•
•Úkol č.2: pipetování do mikrotitrační destičky
• (řady 2-12)

Geometrická řada
destil.voda
600 ml
600 ml
600 ml
600 ml
600 ml
600 ml
600ml
          600 ml
600 ml
600 ml
ŘEDÍCÍHO ROZTOKU
1         2        3        4        5
 1:2       1:4       1:8    1:16    1:32
600 ml
1:1
A
B
C
D
E
F
G
H
1:2
1:4
1:8
ŘED.R.
1:16
1:32
ŘED.R.
H2O
A
B
C
D
E
F
G
H
1:2
1:4
1:8
ŘED.R.
1:16
1:32
ŘED.R.
H2O
sl. 1
sl. 2
Do jamky vždy jen 100ul z naředěné geom. řady.
Zbytek destičky (sl.3-12) dopipetovat pouze ředícím roztokem v objemu 100ul.

PROTOKOLY
v hlavičce:
jméno
datum
úloha č.
název úlohy
v protokolu samotném:
Princip
Postup
Výsledky
Závěr
…grafy…

PROTOKOL Č.1
•Princip: Okomentovat význam správného pipetování
•Postup: pomůcky, schémátko
•Do výsledků: min. hodnota, max. hodnota, průměr, směrodatnou odchylku jen u absorbancí
nenáležejících ke geometrické řadě (sl.3-12)

..konec…