IMUNOESEJE IMUNOESEJE • •tyto metody využívají vazebné reakce mezi protilátkou a ligandem (antigenem), informace o vazbě je zprostředkována pomocí značek •množství značené komponenty v imunokomplexu je závislé na koncentracích výchozích neznačených komponent. PŘÍMÉ NEPŘÍMÉ KOMPETITIVNÍ NEKOMPETITIVNÍ HOMOGENNÍ NEHOMOGENNÍ •Přímé -kvalitativní metodika k průkazu antigenu -Ag – Ab* • •Nepřímé •- průkaz protilátek v séru •- Ag – Ab – Ab* •Kompetitivní -limitované množství reaktantu (protilátka), aby mohlo docházet ke kompetici -značený i neznačený ligand soutěží o vazebná místa protilátky -neznačený antigen blokuje vazbu značeného antigenu, množství vzniklého produktu je nepřímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku -čím víc se naváže značeného ligandu, tím méně neznačeného - • • • • •Nekompetitvní (sendvičová) -protilátka je v nadbytku, všechen analyt je vyvázán -analyt je vázán mezi dvěma specifickými protilátkami -množství vzniklého produktu je přímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku - • http://imunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/imunoreakce.pdf •Homogenní •- není potřeba oddělovat Ab-Ag od volného Ag* • •Heterogenní •- jedna z komponent je navázána na pevnou fázi •- nutnost separace navázaných složek reakce od volných složek reakce (detekční protilátka, konjugát) http://www.scielo.br/img/revistas/bjce/v26n2/a01fig01.jpg Among the different immunoassay formats described in the literature (Stolpera et al., 2007; Tschmelaka et al., 2004; Matsunaga et al., 2003; Sadana et al., 2002; Warsinke et al., 2000), four of them are more commonly used (see Figure 1). In a homogeneous immunoassay (Figure 1a), the antibodies, antigens and labeled antigens are mixed. The antigens freely marked and those which are linked to the antibodies can be distinguished by a change of activity of the marker when coupled. The immunoassays are usually heterogeneous, which means that the antibody or the antigen is immobilized in a solid support and an immunocomplex is formed upon entering into contact with a solution containing the other immunoagent. The non-linked proteins are removed by washing and the answer obtained from the labels is proportional to the amount of linked protein. The more common kind of enzymatic immunoassay used in clinical analyses is known as Enzyme Linked Immune Sorbent Assay, or ELISA. There exist different schemes of enzymatic immunoassays (of competitive and non-competitive type) and, in the clinical analyses practice, two of the most popular methods are the sandwich method and the competitive immunoassay method (Harlow and Lane, 1988). In a non-competitive sandwich immunoassay, the antibodies are immobilized and, after the addition of the sample which contains the antigen, a conjugated or secondary labeled antibody is added (Figure 1b). In a competitive assay, the competition happens between the free and the linked antigen for a limited amount of labeled antibody (Figure 1c) or between the antigen (sample) and the labeled antigen for a limited amount of antibodies (Figure 1d). In the case of the immunosensors, direct assays have been more frequently applied. The most common formats in this field, of fast detection, are the competitive assays and the sandwich assays. IMUNOESEJE ENZYM vizualizace sekundární fáze interakce AgxAb navázanou značkou: RADIOIZOTOP FLUOROCHROM LUMINOFOR RIA -kompetitvní heterogenní metoda -oddělení nukleární medicíny • -detekce reakce Ag-Ab pomocí radioaktivního izotopu jako značky navázané na jednu ze složek reakce , nejčastěji 125I -měří se intenzita radioaktivního zářiče – není třeba přidávat substrát • -vyšetřování hladin různých hormonů a jejich metabolitů, vitamínů a jejich metabolitů, specifického IgE, některých autoprotilátek – např. vyšetření Ab proti acetylcholinovému rec. při myastenia gravis • •FIA – jako značka se používá molekula fluorochromu, detekce signálu se provádí fluorimetricky • •LIA – značka – luminofory (při oxidaci vyzařují světlo), detekce na luminometru • př. bioluminiscence - oxidace luciferinu (enzym luciferáza) – • světélkování světlušek EIA •kovalentní vazba enzymu na některý z reaktantů •heterogenní uspořádání – skupina metod ELISA • (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) • ELISA-schéma http://virus.usal.es/web/demo_microali/enterotoxina/set.html 1.Potažení jamek antigenem 2.Přidání vzorku séra 3.Přídání enzymem značené protilátky(anti-human IgG) 4.Přidání substrátu 5.Odečtení barevné reakce 1 2 3 4 EIA-ELISA I •1 reaktant imobilizován na povrch destičky •detekovaný antigen musí mít 2 různé epitopy •výsledkem je přeměna bezbarvého substrátu na barevný rozpustný produkt – tato přeměna pomocí enzymu na Ab •čím ↑ intenzita zbarvení, tím ↑ koncentrace zjišťovaného Ag ve vzorku •zabarvení se zjišťuje spektrofotometricky EIA-ELISA II •nejen kvalitativní, ale i kvantitativní metoda •lze stanovovat Ab i Ag (pozor na pojmy!!) •k průkazu látek s nízkou koncentrací ve vyšetřovaných vzorcích v mikrobiologické serologii a imunologii: • specifických Ab •Antivirových •Antibakteriálních •Autoprotilátek • nebo Ag ELISA-1.“kautování“ prázdná jamka Ag polystyrén Ab …následuje 2.blokování, 3. nanesení vzorků, atd… •4. Ab s enzymem – křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, • beta galaktozidáza,… • •5. substrát – např. tetrametylbenzidin 6. barevný výsledek 7. hodnocení…kalibrace, cut-off limity ELISA reader