CHEMILUMINISCENČNÍ TEST 3055755 •MEM: 1ml zásobního MEMu + 9ml destil. H2O upravit pH – přidat 50µl NaHCO3 •Luminol: 70µl NaHCO3 + 50µl 0,1 M luminolu + 450µl připraveného MEMu •Luminol 2: 60µl luminolu naředěného výše + 250µl připraveného MEMu •Pipetovací schéma: AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl B C D E F G 3055755 AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl MEM 85 µl luminol 10 µl škrob x krev 10 µl MEM 75 µl luminol 10 µl škrob 10 µl krev 10 µl 3055755 RESPIRAČNÍ VZPLANUTÍ Stimulace povrchové membrány fagocytů – aktivace NADPH oxidázy – zvýšená spotřeba kyslíku a jeho přeměna na reaktivní kyslíkové deriváty O2- … superoxidový anion H2O2 … peroxid vodíku 1O2 … singletový kyslík HOCl ... kyselina chlorná OH. ... hydroxylový radikál DETEKCE KYSLÍKOVÝCH DERIVÁTŮ VZNIKLÝCH V PROCESU RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ •Zesílení přirozené chemiluminiscenční aktivity fagocytů přídavkem luminoforu. • energie chemické reakce •LUMINOFOR LUMINOFOR* • energeticky bohatší, nestabilní • • • • • •Uvolnění přebytečné energie ve formě světelných kvant registrovatelných fotonásobičem luminometru. 3055755 •Fagocytující buňky plná krev izolované polymorfonukleární buňky •Luminofory luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione) lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrát) •Aktivita spontánní stimulovaná •Stimulátory korpuskulární: škrob, opsonizovaný zymozan solubilní: phorbol myristát acetát 3055755 TEST CHEMILUMINISCENCE KINETIKA RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ •Vmax … maximální produkce fotonů •tmax … čas nutný k dosažení maximální produkce fotonů •Hodnota integrované plochy pod křivkou … vyjádření celkového množství fotonů vyprodukovaných systémem za definovaných podmínek 3055755 Vmax tmax PRACOVNÍ POSTUP •Odběr venózní krve do heparinu (5j heparinu/1ml krve). Krev 30 min inkubovat v termostatu při 37°C. Materiál zpracovat do 120 min po odběru. •Krev vyšetřit hematologicky (celkový počet leukocytů, KO). •U každého pacienta vyšetřit: spontánní aktivitu (bez stimulace) i stimulovanou aktivitu (stimulace 1% rýžovým škrobem). •Pipetovací schéma: 3055755 AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl • Měření chemiluminiscence luminometrem ve 3 minutových intervalech po dobu 45 min při teplotě 37oC. • Hodnocení výpočtem integrované plochy pro spontánní i stimulovanou aktivitu a její přepočet na 105 fagocytujících buněk. • Výpočet indexu metabolického vzplanutí (IMV). • Klinický význam vyšetření: • - diagnostika chronické granulomatózy (defekt NADPH oxidázy ) - defekt myeloperoxidázy (srovnání chemiluminiscence lucigenin-luminol) - vliv léčiv na fagocytózu - septické stavy l 3055755