Průtoková cytometrie Flow Cytometry cytology PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE (fluorescenční metoda) • •Měření fyzikálně-chemických vlastností buněk během jejich průchodu laserovým paprskem • •Nejčastěji imunofenotypizace krevních leukocytů a buněk kostní dřeně • (povrchové znaky i intracelulární) • •Standardní metoda analýzy částic (většinou buněk) v suspenzi • •Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda, umožňuje současné měření několika parametrů na velkém množství částic • • C:\Users\Uživatel\Desktop\glb_bci_003979.jpg •buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické molekuly – znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky a její aktivace • •CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen číslem (CD1, CD2, CD3,…). V současné době je na lidských leukocytech charakterizováno více než 400 znaků. • •Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul. Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce. Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech , trombocytech či jiných buněčných populacích. • • Cluster of Differentiation CD8 CD4 TCR Znak: buněčná populace: CD3 T-lymfocyty CD4, CD8 CD19, CD20, CD21 B-lymfocyty CD16/CD56 NK buňky CD14/DR Monocyty HLA-DR; CD25; CD69 Aktivační znaky Průtokový cytometr 1.FLUIDNÍ SYSTÉM 2. 2.OPTIKA 3. 3.ELEKTRONIKA http://www.abdserotec.com/resources/flow-cytometry-ebook/principles-of-the-flow-cytometer/signal-pr ocessing.html 1.FLUIDNÍ SYSTÉM •Zajišťuje transport bb. •v nosné tekutině (pod tlakem) •do průtokové komory. Buňky se •pohybují jedna za druhou • •(na základě hydrodynamické fokusace - nosná tekutina •(destil. voda, komerční tekutiny) bývá do komory přinášena tenkou •Kapilárou pod větším tlakem než suspenze částic, které jsou tak •udržovány jen v úzké centrální části proudu. Zrychlení vznikající při •výstupu vodního paprsku z komůrky nutí částice pohybovat se jedna •za druhou. C:\Users\Uživatel\Desktop\Flow-cytometry-picture.jpg http://withfriendship.com/user/mithunss/flow-cytometry.php 15µm Velikost buněk: Forward Scatter Přímý rozptyl - úměrný velikosti buňky Granularita buněk: Side Scatter Boční rozptyl – indikátorem vnitřní buněčné struktury (granularity) •2. OPTIKA •Excitační část – laser •Sběrná část – systém čoček, zrcadel a optických filtrů zachycující fluorescenci částic •vyzářenou po jejich projití světelným paprskem http://www.semrock.com/flow-cytometry.aspx •3. ELEKTRONIKA •Převádí optické signály (fluorescenci) na signály elektronické (fotonásobiče, fotodiody). •Po zesílení signálu a dalším zpracování dojde k jeho digitalizaci pro počítačovou analýzu Bllod Analysus Flow Cytometry http://healthcare.analog.com/static/imported-files/microsites/healthcare/pop_blood_analysis_fc.html Průtokový cytometr Laser [USEMAP] Systém hnací tekutiny přináší vzorek do komory kde jsou buňky jedna po druhé vyšetřovány laserovým paprskem Zkumavka se suspenzí buněk [USEMAP] Sběrná optika (čočky, zrcadla, filtry, světlovodná vlákna) třídí světelný signál Podle barvy se světlo a přivádí ho na jednotlivé detektory (Opto)elektronika převádí optický signál na elektrický, ten zpracovává a údaje jsou posílány do počítače Speciální počítačové programy umožňují zobrazit a vyhodnotit výsledky analýzy – každá vyšetřená buňka má přiřazené hodnoty parametrů (0 – max) a buňky jsou vyhodnocovány kolektivně, tedy jako populace Excitační optika (lasery, světlovodná vlákna, zaostřovací a tvarovací prvky) přivádí budící záření do komory lymfocyty monocyty granulocyty granularita •POLYKLONÁLNÍ PROTILÁTKY •protilátky vznikající při přirozené odpovědi imunity na antigen jsou polyklonální. •jsou zaměřené proti různým epitopům antigenu a tvořeny mnoha klony B lymfocytů - na rozdíl od monoklonálních nejsou zcela totožné •MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY •protilátky jsou produktem jediného klonu B lymfocytů (klony vzniklé fúzí buněk produkujících protilátky a myelomových buněk, jež schopnost produkce svého vlastního imunoglobulinu ztratily) •jsou naprosto totožné a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu http://www.bio.davidson.edu/Courses/molbio/MolStudents/01rakarnik/monoclonal.gif http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/monoclonal.php Protilátky vznikající při přirozené odpovědi imunity na antigen jsou polyklonální. Jsou zaměřené proti různým epitopům antigenu a tvořeny mnoha klony B lymfocytů, z hlediska svých vlastností jsou heterogenní. Naproti tomu monoklonální protilátky (MP) jsou produktem jediného klonu B lymfocytů, jsou naprosto homogenní a přísně specifické proti jedinému epitopu. To z nich činí mimořádně vhodný nástroj přesné diagnostiky, a – úměrně tomu, jak jsou poznávány molekulové mechanizmy chorob – i přesně cílené léčby. Technika přípravy MP byla v r. 1975 vypracována Köhlerem a Milsteinem. Její podstatou je izolace jednotlivých B lymfocytů z krve imunizované myši a jejich fúzování s buňkami myelomu, které jim poskytne nesmrtelnost. Získaný hybridom pak může tvořit neomezené množství monoklonální protilátky. •Fluorochromy: -Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty • FITC, Cyaniny, Texas Red, řada Alexa, řada Pacific and Cascade, • AmCyan, Propidium iodide, 7-AAD, CFSE, -Fluorescenční proteiny • Phycoerythrins (B, R), Allophycocyanin, PerCP, • GFP a jiné fluorescenční proteiny • •Schopné absorbovat fotony budícího záření (např. 488 nm) •a následně (10-8 s) emitovat fotony s •delší vlnovou délkou (v tomto případě 500 – 800 nm). •Fluorescenční světlo má tedy jinou barvu Fluorescence Emisní spektrum Absorbční spektrum Barva pohlceného a vyzářeného světla se liší Vlnová délka (λ) Stokesův posuv Energie (E) Fluorescence E = h.c/l Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii -rozdíl mezi vlnovými délkami emisního a excitačního maxima (nm) Část energie se přemění na energii vibrační CD3 CD4 • • Krevní diferenciál Vyšetření lymfocytů periferní krve ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu 58-85 CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace 30-60 CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 15-35 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 6-20 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech) Hodnocení nálezu jednotlivých subpopulací Snížení/ zvýšení subpopulace onemocnění ¯ CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii) ¯ CD19+ u některých pacientů s CVID CD19+ B – buněčná leukémie ¯ CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi CD3+ T – buněčná leukémie ¯ CD4+ u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV) CD4+ autoimunity, alergie ¯ CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systematický lupus erythematodes-SLE) CD8+ u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV) Příklady klinických a experimentálních aplikací průtokové cytometrie Vyšetření: Povrchových antigenů imunofenotypizace, HLA-B27, receptory pro cytokiny… Intracelulárních antigenů myeloperoxidáza Buněčná DNA kinetika buněčného cyklu, hodnocení apoptózy nekrózy…. Protilátky stanovení hladin terapeutických protilátek Funkcí test blastické transformace lymfocytů, fagocytóza a oxidační vzplanutí, NK-cytotoxicita Aktivita enzymů, vnitřní prostředí buněk…. HLA-B27 asociace HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění, jako jsou záněty kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkých kostí rukou, nohou a šlach, dále lupénka (psoriasis), vyrážek, chronické bolesti spodní části zad a spondyloarthropatie, z nichž nejznámější je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění osového skeletu a kloubů - Bechtěrevova nemoc). negativní pozitivní Test aktivace bazofilů (basotest) funkční test umožňující vyšetření aktivace basofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro Převzato z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE) - CD203c založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní) - sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů negativní pozitivní •9ml heparinizované krve •hustotní gradientová centrifugace • (separační medium - lymphoprep) •rozsuspendováno v RPMI-1640 • s přídavkem 10% fetálního séra •300ml suspenze + monoklonální protilátky – inkubace •promytí v PBS a naředění •měření na průtokovém cytometru plazma, destičky lymfocyty, monocyty granulocyty, erytrocyty IZOLACE LYMFOCYTŮ Izolace lymfocytů •10 ml krve – pro čtyři studenty •10ml krve smíchat s 10 ml RPMI v kontejnerku, promíchat •do prázdné zkumavky napipetovat 3,5 ml Lymphoprepu •pasterkou nanést OPATRNĚ na povrch Lymphoprepu cca 5 ml krve smíchané s RPMI (ve skupině 4 rovnoměrně = stejná hladina), vrstvy se nesmí promíchat •stáčet při 2500 ot. /30 min •po centrifugaci: bílý proužek cca uprostřed je vrstva lymfocytů oddělený na základě odlišné vznášivé hustoty •odstranit do koše vrchní vrstvu krevní plazmy •kroužek lymfocytů přenést do nové zkumavky (vždy 2 studenti do 1 zkumavky) •doplnit do plného objemu PBS a PROMÍCHAT pasterkou •centrifugovat 1800 ot./10 min Izolace lymfocytů 2 •zkontrolovat zda jsou lymfocyty zcentrifugovány na dně zkumavky •slít tekutinu •přidat 1 ml PBS •dobře promíchat •nechat spočítat lymfocyty pomocí přístroje pro počítání leukocytů – naměřená hodnota udává počet lymfocytů x106/ml • •další možný postup – nasazení buněk s monoklonálníma protilátkama •měření na průtokovém cytometru Izolace lymfocytů 3