Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 1: Úvod Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz Dnes máme na programu nCo je to mikrobiologie nCo je to humánní klinická mikrobiologie nCo je to laboratoř klinické mikrobiologie (hlavně bakteriologie), jak funguje a proč funguje právě tak, jak funguje nKteré jsou lékařsky významné mikroby a kterými metodami je zkoumáme Zkouška, literatura nZkouška z lékařské mikrobiologie se dělá na konci druhého semestru. Má praktickou a teoretickou část. U teoretické části si vytáhnete trojici otázek. Otázek je celkem 120 nDoporučenou knihou je „Lékařská mikrobiologie – vyšetřovací metody“, je ale hodně objemná a také poměrně drahá. Můžete také studovat s těchto prezentací (všechny budou postupně viset na ISu ve Studijních materiálech) a dalších materiálů, které vám poskytneme. Abych se představil nMUDr. Ondřej Zahradníček npovolání: klinický mikrobiolog, asistent na LF MU; učíme u nás bakalářské obory, mediky, zubaře i studenty přírodovědecké fakulty nmožná některé z vás povedu i v rámci bakalářské práce nkdybyste cokoli potřebovali, obracejte se na mne nJelikož nemám „PhD“, nemohu vás zkoušet, zkoušet vás proto budou kolegyně, možná i kolega Náš ústav Provoz (analýza klinických vzorků) Výuka Výzkum Obrázek1 Foto: Archiv MU Medici ve velké praktikárně PC210117 Foto: Archiv MU Historie mikrobiologie nPrvní mikroby („animalcula“) pozoroval Antony van Leeuwenhoek, díky tomu, že jako první sestrojil dostatečně zvětšující mikroskop nZásluhu na dnešní podobě mikrobiologie mají Louis Pasteur a Robert Koch, kteří propracovali mikrobiologické metody a popsali mnoho jednotlivých druhů bakterií Historie klinické mikrobiologie a imunologie nKlinická mikrobiologie se jako samostatný obor odštěpila začátkem 20. století z patologie. Do té doby se diagnostikou mikrobiálních původců ve vzorcích pacientů zabývali patologové nO více než půlstoletí později se z mikrobiologie vyčlenila imunologie, tedy věda o obranyschopnosti organismu. Ta se často dala dohromady s alergologií, a více než mikrobiologie pracuje i s pacienty, nikoli tedy jen s jejich vzorky. Humánní klinická mikrobiologie – co to je nJe to průnik množiny všelijakých mikrobiologických oborů a množiny lékařských oborů. nPro lékaře jsme příliš mikrobiologičtí. Pro mikrobiology z přírodovědecké fakulty jsme příliš lékařsky zaměření nVeterináři nám nadávají (a mají někdy pravdu), že si myslíme, že klinická mikrobiologie je jen ta humánní. Ve skutečnosti existuje i veterinární obdoba – veterinární klinická mikrobiologie Klinická mikrobiologie Humánní klinická mikrobiologie Veterinární klinická mikrobiologie Obecná mikrobiologie Molekulární biologie a genetika Buněčná biologie Infekční lékařství Dermato- venerologie Epidemiologie infekčních nemocí Mikrobiologie rostlin Kdo jsou mikrobiologové Klinická mikrobiologie Průmyslová mikrobiologie Jiné medicínské obory Chemicko- technologic. školy Přírodovědecké a podobné fakulty Lékařské fakulty Základní mikrobiologický výzkum Na našem ústavu jsou lékaři a další odborníci. 69 virus-HIV-01 Virus HIV http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm Co nás čeká v tomto předmětu nPovídání o určování mikrobů a vůbec o práci v laboratoři klinické mikrobiologie nPovídání o klinicky významných mikrobech a jejich vlastnostech nNěco o dekontaminaci a antibioticích nDrobné exkurze do styčných oblastí mezi mikrobiologií, imunologií, epidemiologií apod. 74 virus-ebola-Filoviridae Ebola http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm Co je to mikrob nMusí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické nMusí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá nZ druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická. 35 10 Bakterie Helicobacter a kolem ní schematicky její genom http://biology.plosjournals.org/archive/1545-7885/3/1/figure/10.1371_journal.pbio.0030040.g001-M.jp g Co jsou všechno mikroby nMikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea (dříve archeobaktérie), různé organismy schopné vydržet hluboko pod mořem nebo v extrémních podmínkách horkých pramenů nJako klinického mikrobiologa mne tyto mikroby neživí, přesto musím uvést, že jsou zajímavé a úžasné Co tyhle mikroby umí nPřežívají v moři v hloubce 10 km nPřežijí i teploty kolem 110 stupňů Celsia nVydrží značnou radioaktivitu nJsou schopny místo kyslíku „dýchat“ síru či dusík (zkrátka, mají jiný akceptor elektronů než atom kyslíku) nMnoho věcí ovšem umějí i mikroby lékařsky významné, jak si povíme dále 18 meningokokken_250 Neisserie www.meningitis.de/erreger/meningokokken.html. Třídění živých organismů nPriony – neobsahují DNA, většinou se vůbec nepovažují za živé organismy nViry a bakteriofágy nBuněčné organismy nArchea (archeobakterie) nEubacteria (eubakterie) nEucarya (eukaryotní organismy) •jednobuněčné •mnohobuněčné Klinicky významné mikroby nKlinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo (ne tedy pro člověka = tvůrce, ale pro člověka = objekt) n„Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo dokonce pomáhají nKaždý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. Dokonce i mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy). 20 10 Neisseria gonorrhoeae http://medicine.plosjournals.org/archive/1549-1676/2/1/figure/10.1371_journal.pmed.0020024.g001-M.j pg Hlavní klinicky významné mikroby (a jiné organismy) nViry (a priony) nBakterie (třeba streptokok, Escherichia) nHouby (kvasinky a plísně) nParaziti – přesahují pojem mikrob: nVnitřní paraziti •Prvoci (třeba původce malárie) •Motolice (třeba motolice jaterní) •Hlístice (třeba roup nebo škrkavka) •Tasemnice (třeba tasemnice dlouhočlenná) nVnější paraziti (většinou členovci, tedy například vši, blechy, štěnice) Humánní klinická mikrobiologie se proto dělí na podobory: nlékařská bakteriologie nlékařská virologie nlékařská mykologie nlékařská parazitologie nněkdy se ještě zvlášť vyčleňuje serologie, tj. obor, který se zabývá průkazem protilátek proti mikrobům, případně i průkazem antigenů v séru Co nás zajímá o mikrobech morfologie jaký mají tvar a uspořádání struktura z čeho se skládají fyziologie jak se chovají metabolismus jak a čím se živí odolnost jak vzdorují výkyvům klasifikace jak jsou vzájemně příbuzné Co nás zajímá o klinicky významných mikrobech patogenita které orgány osidlují a jak patogeneze jakým způsobem případně škodí přenos jak se přenášejí inkubační doba jak dlouho trvá, než se projeví diagnostika jak je můžeme poznat léčba a prevence co proti nim můžeme dělat Rozdělení virů nDNA viry, například nherpesviry – HSV, VZV, EBV, CMV, HHV6 nadenoviry – některé respirační virózy npapovaviry – například urogenitální papilomaviry nparvoviry – například původce páté dětské nemoci nvirus žloutenky B nRNA viry, například nenteroviry – polio, coxsackie, ECHO nrhinoviry – viry rýmy nviry chřipky, parachřipky, spalniček, zarděnek, příušnic nviry žloutenek A, C, D, E nrůzné viry klíšťových encefalitid, tropických viróz, vztekliny, horeček Lassa a Ebola nvirus HIV Rozdělení bakterií 1 npodle tvaru a uspořádání nkoky – kulovité, tvoří dvojice, řetízky, shluky… ntyčinky – protáhlé, mohou být rovné, zahnuté… nkokotyčinky (kokobacily) – mezi koky a tyčinkami nspirochety – ve tvaru spirály nbez tvaru – např. mykoplasmata npodle tzv. Gramova barvení (dáno typem buněčné stěny) ngrampozitivní – barví se fialově ngramnegativní – barví se červeně nGramem se nebarvící – jiný typ stěny či bez stěny Rozdělení bakterií 2 npodle vztahu ke kyslíku nstriktně aerobní (rostou pouze v přítomnosti kyslíku) nstriktně anaerobní (vyžadují atmosféru bez kyslíku) nfakultativně anaerobní („přepínají“ metabolismus) naerotolerantní (v praxi neodlišitelné od předchozích) nmikroaerofilní (potřebují kyslík, ale musí ho být málo) nkapnofilní (potřebují kyslík, ale také zvýšený podíl CO2 v atmosféře) nv praxi často jen aerobní / anaerobní Přehled klinicky významných bakterií, o kterých bude hodně řeč: část první nNejdůležitější grampozitivní koky: nStaphylococcus: S. aureus, koaguláza-negativní stafylokoky nStreptococcus: hemolytické, viridující, streptokoky bez hemolýzy (gamahemolytické) nEnterococcus: E. faecalis, E. faecium NeEc2 NeEc1 Část druhá nNejdůležitější grampozitivní tyčinky: nListeria, Corynebacterium, Bacillus (ten je sporulující, tj. tvoří spory) nNejdůležitější gramnegativní koky: nNeisseria (N. gonorrhoeae – „gonokok“, N. meningitidis – „meningokok“, „ústní“ neisserie) nMoraxella catarrhalis – také Branhamella catarrhalis Část třetí nNejdůležitější gramnegativní tyčinky: nEnterobakterie: obligátní patogeny: Salmonella, Shigella, Yersinia; oportunní patogeny: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Providencia, Morganella, Serratia, nGramnegativní nefermentující tyčinky (popř. i kokotyčinky, event. koky): Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Burkholderia, Stenotrophomonas nOstatní: Haemophilus Pasteurella (rány po pokousání psem); Campylobacter, Helicobacter; Vibrio (např. V. cholerae); Legionella, Bordetella Francisella Část čtvrtá nNejdůležitější anaeroby: nClostridium (C. tetani, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens a jiná tzv. „klostridia plynatých snětí) – grampozitivní sporulující tyčinky nActinomyces – původce aktinomykózy nOstatní anaeroby většinou působí ve směsi. Např. Propionibacterium, Peptococcus, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium či koky Veillonella gramnegativní. Část pátá nNejdůležitější spirochety: nTreponema, Borrelia, Leptospira nNejdůležitější z ostatních bakterií: nMycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae), Mycoplasma (M. pneumoniae, M. hominis), Ureaplasma (U. urealyticum), rickettsie, chlamydie Diagnostika: průkaz a určování mikroorganismů nKlinická mikrobiologie v praxi spočívá v tom, že lékař (ať už je to obvodní lékař, ambulantní specialista či lékař z kteréhokoli oddělení nemocnice) pošle do laboratoře vzorek nÚkolem klinickomikrobiologické laboratoře je prokázat v takovém vzorku případnou přítomnost mikrobů a pokud tam jsou, tak je také určit. nUrčení nemusí být přesné, ale musí poskytnout dostatek informací pro léčbu Co je to vzorek nVzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře, většinou: nkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) nstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. nPři diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. Co je to kmen nKmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba nKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. nKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. Cíle mikrobiologického vyšetření nZjištění mikrobiálního agens npřímo (prokážeme mikroba, jeho součást či produkt ve vzorku; v případě izolačních metod sem patří i identifikace kmene) nnepřímo (prokážeme protilátky, které si makroorganismus vytvořil jako odezvu na antigenní výzvu) nJen někdy též: zjištění in vitro citlivosti mikrobiálního agens na antimikrobiální látky (kultivovatelné bakterie a houby) Přehled metod nMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální jed – toxin) nPřímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem (močí, krví, výtěrem z krku a podobně) nIdentifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu nMetody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu, odezvou na činnost mikroba Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů Proč se mikrobiologická diagnostika zabývá nejvíc bakteriemi nHouby a paraziti, při vší úctě, způsobují relativně méně onemocnění člověka než viry a bakterie. Problematika mykologie a parazitologie je hodně speciální a moc se nehodí do všeobecné mikrobiologie nZabývat se viry je obtížné a zatím to nemá zpravidla příliš velký praktický dopad (to „zatím“ znamená, že situace se možná změní po praktickém zavedení zjišťování citlivosti na antivirotika) Proč je méně klinických virologů než bakteriologů nMnohá virová onemocnění (hlavně dětská) se projevují typickými klinickými příznaky a nevyžadují laboratorní diagnostiku nMnohá virová onemocnění se neléčí kauzálně, tj. léčí se pouze příznaky. Je-li tomu tak, není nutno bezpodmínečně znát původce. nVirologická diagnostika je obtížnější a dražší a proto se pro ni rozhodujeme jen když je opravdu pádný důvod Jak je organizována laboratoř klinické mikrobiologie nPříjem vzorku. Dobrý primář se pozná podle toho, že ví, že právě příjem je nejdůležitější součástí laboratoře. nVlastní vyšetření. Pokud je kultivační, trvá několik dnů až mnoho týdnů (některé viry, plísně, mykobakteria). Některá jiná (mikroskopie, průkaz antigenu) mohou být hotová během několika desítek minut. nExpedice výsledku v takové formě, aby umožnila správnou interpretaci Rozdíl mezi klinickou bakteriologií a bakteriologickým výzkumem nBadatel má relativně dost času. Když mu to dlouho trvá, nikdo na něj vztekle neřve do telefonu. nBadatel na druhou stranu musí diagnostikovat přesně. Klinickému mikrobiologovi jeho klienti rádi odpustí, pokud bakterii určí jen rodově či skupinově, jen když to rychle. nKlinika ostatně více zajímají léčebné možnosti, než přesný název mikroba. Rozdíl mezi klinickou mikrobiologií a klinickou biochemií – 1 nDoba biochemického stanovení závisí převážně na organizaci práce v.biochemické laboratoři nDoba mikrobiologického vyšetření závisí převážně na tom, jak rychle se těm potvůrkám uráčí vyrůst; sebeúpornější a sebezavilejší ortoped či doktor z ARK jim nedokáže poručit. Neplatí to ovšem u metod, kde se mikroby nekultivují Rozdíl mezi klinickou mikrobiologií a klinickou biochemií – 2 nBiochemik (ale i serolog) pracuje takto: nStanovení 1 à výsledek 1 nStanovení 2 à výsledek 2 nStanovení 3 à výsledek 3 nBakteriolog pracuje jinak: nVzorek à metoda à podle výsledku případně kupa dalších metod à možná časem i nějaký výsledek nBakteriologie se mnohem hůř automatizuje Rozdíl mezi klinickou mikrobiologií a klinickou biochemií – 3 nDalším rozdílem jsou i typy vzorků. Biochemici pracují téměř výhradně se sérem, plazmou a močí. Mikrobiolog u nepřímého průkazu rovněž pracuje se sérem. U přímého průkazu je však nutno použít vzorek odpovídající lokalizaci mikroorganismu. A to může být skoro cokoli. Typy vzorků nTekuté a kusové materiály se zasílají zpravidla ve sterilních nádobkách různého tvaru a velikosti. Může to být krev, moč, mozkomíšní mok a různé jiné tělní tekutiny nVýtěry a stěry se zasílají zpravidla zanořené do transportní půdy, nejčastěji Amiesovy nZvláštní případy: zaslání sklíčka s.nátěrem, speciální odběrové soupravy (hemokultury) aj. Algoritmy nBakteriologické vyšetření je ve své podstatě algoritmus. Je podobné kriminalistice – postupně se zužuje okruh podezřelých, až je pachatel usvědčen. (A jako v kriminalistice, i zde mohou nastat „justiční omyly“) Stafylokoky Příklad Diagnostika stafylokoků. Poté, co zjistíme, že náš kmen je grampozitivní kok, určujeme ho dalšími testy. Přitom vědomě pomíjíme klinicky nevýznamné a vzácné rody a druhy. Riziko omylu ovšem musí být přijatelné. Časový faktor nV „den 0“ obvykle pouze přijde vzorek. Provést lze leda mikroskopii, přímý průkaz antigenu ve vzorku či průkaz DNA nV „den 1“ či „den 2“ je k dispozici výsledek kultivace. Když je podezřelý nebo pozitivní, pokračuje diagnostika do dalšího dne nNegativní výsledky se expedují v „den 1“ nebo „den 2“, pozitivní v „den dva až „den 5“ podle situace Den 0. (přijatá stolice) nNegativní výsledek je za 48h Pozitivní za 72h a později selenit 24 h 48 h identifikace endo endo XLD MAL MCs KA Nacl CCDA CIN + 72h 42°C 28°C *Není-li uvedeno jinak kultivace probíhá při 37°C Příklad Obrázek L. Černohorské 09 Listeria Nashledanou nPříště budeme pokračovat povídáním o morfologii mikrobů http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Listeria