Suchá chemie Miroslava Beňovská (vychází z přednášky doc. Šterna) Využití •Močová analýza – diagnostické proužky • •POCT – imunoanalytické kazety, diagnostické proužky • •Automatické analyzátory – řada analyzátorů Vitros, Ortho • Průběh reakce •Analyzovaný vzorek (moč, krev, sérum nebo plasma) je aplikován na povrch pevné fáze • •Difunduje do její matrice (u plné krve krevní elementy zůstanou na povrchu – filtrace) a rozpouští suché činidlo, které je v matrici dispergováno • •Rozpuštěné činidlo reaguje s analyzovanou látkou za vzniku barevného produktu • •Výsledné zbarvení na povrchu pevné fáze je sledováno vizuálně nebo instrumentálně Typy matrice pro suchá činidla • •Impregnovaná vlákna – stanovení moče, stanovení glukózy • •Vícevrstvý film (želatina) • - vyvinuty pro kapacitní laboratorní analyzátory stanovující komponenty krve, séra nebo plasmy • - imunochemické POCT analyzátory Celulózová impregnovaná vlákna •Celulózová matrice (firma Bayer – Siemens) porézní či polopropustná • •Reagencie v suché formě distribuovány • - do matrice • - na povrchu matrice • •Postupná impregnace a zasoušení jednotlivých činidel • •Činidla oddělena separační vrstvou polymeru (ta při hydrataci praskne) Reflexní fotometrie •Impregnovaná vlákna mají vysokou opacitu (neprůhlednost) • •Ke stanovení jejich zbarvení nutno využít reflexní fotometrii • - měření reflexe plochy na kterou byl aplikován vzorek (Bayer – Siemens) • - měření ze stejné strany jako nanesen vzorek, ale na jiném místě (Roche, vhodné i pro plnou krev – přístroj Reflotron) • - měření z opačné strany než aplikován vzorek (vícevrstvé filmy) Stanovení z plné krve – skleněná vlákna (přístroj Refletron) •Vrstva skleněných vláken je vhodná: •ke kvantitativnímu zadržení erytrocytů • •zajištění dávkování vhodného množství plasmy na reakční vrstvu (vzhledem k různému množství hematokritu nesmí být plasmy nedostatek ani přebytek) – vrstva skleněných vláken – rezervoár plasmy • Skleněná vlákna •Transportní vrstvou se dostává plasma pod reakční zónu • •Start reakce se provede přitlačením reakční zóny na rezervoár plazmy • •Tím si reakční zóna odebere • potřebné množství vzorku a • přebytek je vytlačen mimo • reakční zónu Vícevrstvý film •Technika poprvé popsána v r.1978 • •Činidla neobalují vlákna – jsou uložena v tenkých plochých vrstvách • •Jako podkladová báze bílkovina – zpravidla želatina • •Činidla umístěna v matrici hydrofilního polymeru – ten nanesen na průhlednou plastovou fólii (během nasávání polymer zbobtná – tak reguluje množství séra) Vícevrstvý film Stanovení močoviny - film má pět vrstev: 1.Zadržení vysokomolekulárních látek a reflexní vrstva při fotometrii 2.Reagenční vrstva – hydrofilní matrice s ureázou hydrolyzuje močovinu na NH3 + CO2 3.Semi permeabilní membrána – propouští amoniak 4.Indikátorová vrstva – barevná reakce mezi NH3 a merocy- aninovým indikátorem 5. Transparentní vrstva jako nosič Vícevrstvý film – příklad imunoanalytického stanovení •Imunologické destičky obsahují vrstvy s protilátkou •Nízkomolekulární analyty – kompetitivní princip (digoxin) •Vysokomolekulární analyty - nekompetitivní princip (CRP) • Vícevrstvý film - využití • •Firma Fuji – horní rozptylová vrstva z tkaniny na bázi celulózy (zachytí destičky a erytrocyty) • • •Vyšší homogenita matrice filmu umožňuje získat přesné výsledky (Johson & Johson) - využití na analyzátorech J& J Vitros 250 a 950, Ortho - ty nahrazují klasické automatické analyzátory Analyzátory řady Vitros, Ortho •Pracují bez kapalných reagencií •Reakční zónu tvoří tzv. „slide“, na kterém je • zabudována suchá reagenční multivrstva na podložce z polystyrenu •Princip - reflexní fotometrie - výpočet koncentrace využívá Williams – Clapperova vztahu – pro kalibrační křivku nutné tři koncentrační hladiny • - potenciometrie •Doba analýzy - test do 5 minut J & J Vitros 950 J a J Vitros 950, Ortho