Téma P08: Laboratorní diagnostika tuberkulózy, aktinomycet a nokardií Úkol 1: Mikroskopie acidorezistentních a částečně acidorezistentních mikroorganismů Zatímco acidorezistentní mikroorganismy (Mycobacterium) nelze barvit dle Grama, mikroby acidorezistentní pouze částečně (Actinomyces, Nocardia) mohou být Gramem obarveny, ale barví se nekonstantně, a také nabývají větvených filamentózních forem. a) Barvení (negativního) klinického materiálu barvicí metodou dle Ziehl-Neelsena ________________________________________________________________________________ Ziehl-Neelsenovo barvení se používá u mykobakterií (M. tuberculosis, M. leprae), ale také u některých parazitů (Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis). Acidorezistentní organismy se barví pouze při zahřátí*, avšak zato je pak neodbarví ani tzv. „kyselý alkohol“ (roztok alkoholu s HCl nebo H[2]SO[4]). Poté je odbarvené pozadí obarveno kontrastní barvou. Obarvěte negativní vzorek sputa de Ziehl-Neelsena (varianta s methylenovou modří). Mikroskopujte. Zde acidorezistentní tyčinky nenaleznete. Zakreslete výsledky, uvidíte především přirozené pozadí, tj. leukocyty, epitelie a další objekty. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). Popište také barvicí proceduru – do následující tabulky zapište názvy činidel používaných při barvení 1. Během barvení se preparát , dokud 2. Činidlo je směsí a 3. Místo tohoto barviva lze použít také b) Mikroskopie mykobakteriální kultury ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si v mikroskopu (imerze, imerzní objektiv) mykobakteriální kulturu barvenou dle Ziehl-Neelsena. Zaznamenejte zejména přítomnost acidorezistentních tyčinek. Zakreslete pozorované. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). c) Mikroskopie kmenů aktinomycet a nokardií ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si mikroskopicky Gramem barvené sklíčko. Popište a zakreslete pozorované objekty. Povšimněte si velkého polymorfismu organismů (od kokovitého tvaru přes tyčinky až po vlákna, často větvená); grampozitivní, ale často až gramlabilní). Opět obrázek i popište. Úkol 2: Kultivace mykobakterií, aktinomycet a nokardií Kultivační nároky acidorezistentních a částečně acidorezistentních bakterií jsou velmi různorodé. v Pro Mycobacterium tuberculosis používáme tekuté (Šula, Banič) a pevné půdy (Ogawa, Löwenstein-Jenssen). Pevné půdy se liší od většiny půd používaných v bakteriologii, protože neobsahují agar; jejich „pevnost“ je dána koagulovanou vaječnou bílkovinou. Před kultivací je nutno vzorky mořiti. v Pro rod Nocardia postačuje běžný krevní agar. v Pro rod Actinomyces je nutný VL-agar a kultivace v anaerostatu či anaerobním boxu (viz P07), protože jsou anaerobní. *Zahřátí lze případně nahradit použitím vysoce koncentrovaného karbolfuchsinu a vysoce koncentrovaného fenolu; tato modifikace Ziehl-Neelsenova barvení (dle Kinyouna) nevyžaduje zahřívání. a) Popište půdy pro kultivaci mykobakterií Název půdy tekutá/pevná barva poznámky b) Popište a zakreslete růst kolonií rodů Mycobacterium, Actinomyces a Nocardia na (v) daných médiích Baktérie Název půdy Přítomnost/nepřítomnost růstu, případně charakterizace růstu (charakterizujte růst vlastními slovy) Mycobacterium Actinomyces krevní agar VL agar Nocardia krevní agar VL agar Úkol 3: Určení citlivosti na antimikrobiální látky K léčbě mykobakteriálních infekcí se používají speciální léky zvané antituberkulotika. Liší se také způsob testování citlivosti: antituberkulotika se přímo přidávají do půdy. Zato infekce působené rody Actinomyces a Nocardia se léčí „normálními“ antibiotiky a citlivost se testuje „normálním“ difusním diskovým testem. a) Určení citlivosti mykobakterií na antituberkulotika Porovnáním s kontrolní zkumavkou odečtěte testy citlivosti kmenů mykobakterií na antituberkulotika. Antituberkulotikum Kontrola růstu Růst A/N Interpretace b) Citlivost na antibiotika u kmenů Nocardia a Actinomyces Proveďte in vitro testování citlivosti na antibiotika u nokardií a aktinomycet. Na stole naleznete difusní diskové testy. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivosti. Na kartičce máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Kmen Antibiotikum (celé jméno) Æ zóny (mm) Interpretace Æ zóny (mm) Interpretace Úkol 4: PCR v diagnostice TBC Jelikož je kultivace mykobakterií obtížná, stává se PCR velmi důležitou diagnostickou metodou. Odečtěte výsledek PCR TBC (z prezentace), zapište a interpretujte výsledky Pacient č. Proužek vzorku Interní kontrola Interpretace 1 2 3 4