Precipitace, radioimunodifúze (RID), nefelometrie, turbidimetrie Mgr. Jana Nechvátalová Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny http://www.wikipremed.com/image.php?img=040708_68zzzz382750_255px-Antibody.svg_68.jpg&image_id=3827 50 Ag - Ab http://www.wikiskripta.eu/index.php/Soubor:IMUNOGLOBULIN.png#filelinks - antigen vazebná aktivita hypervariabilní oblasti epitop paratop afinita ≠ avidita •afinita - síla interakce mezi jedním • paratopem a jedním epitopem • •avidita - závislá na afinitě • - vazebná energie mezi komplexním • antigenem a protilátkou • - bere v úvahu valenci Ag a Ab • Aglutinace x precipitace •Aglutinace •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát •makromolekulární •korpuskulární •nerozpustný • •Protilátky namířené proti epitopům antigenních částic vytváří mezi •korpuskulemi můstky, které vedou ke vzniku shluků – aglutinátů. •jako Ag slouží např. těla bakterií • •Precipitace •Ag + Ab ® Ag-Ab •precipitinogen precipitin precipitát •nízkomolekulární •nekorpuskulární •rozpustný • •Reakce mezi solubilním antigenem a protilátkou s následným vznikem •precipitátu (hydrofobní vazby – nerozpustný komplex). • • Aglutinace Přímá Ag jsou přirozeně součástí povrch. struktur reagujících částic Př. hemaglutinace Nepřímá Ag navazujeme na povrch částice uměle Př. latex-fixační test – Ag nebo Ab navázaný na latex. částici, pokud dojde k aglutinaci, dokazujeme přítomnost Ab nebo Ag Revmatoidní faktor (Rf) je protilátka proti lidskému gamaglobulinu běžně vyskytující se v séru ve vysokých koncentracích za určitých podmínek, zejména u pacientů trpících revmatoidní artritidou Latexové částice potažené lidským gamaglobulinem. Při zvýšené konc. Rf dojde k aglutinaci (pozitivní výsledek) Coombsův test (antiglobulinový test, AGT) •umožňuje detekci červených krvinek, pokrytých imunoglobuliny (antierytrocytární protilátky) nebo složkami komplementu • • • • http://cs.wikipedia.org/wiki/Coombs%C5%AFv_test nepřímý umožňuje detekci antierytrocytárních protilátek přítomných v pacientově séru či plazmě z důvodu „in vitro“ senzibilizace červených krvinek nepřímý Coombsův test je užíván k prenatálnímu testování těhotných žen a k testování krve před krevní transfúzí. Slouží k detekci protilátek proti červeným krvinkám, které jsou přítomny volně nenavázané v séru pacienta. V tomto případě je sérum extrahováno z krve a následně inkubováno s erytrocyty se známou antigenicitou a s protilátkami proti lidským imunoglobulinům. Pokud dojde k aglutinaci, je nepřímý Coombsův test pozitivní. přímý umožňuje detekci červených krvinek senzibilizovaných imunoglobuliny a složkami komplementu „in vivo“ přímý Coombsův test se užívá k detekci protilátek či proteinů komplementu, které jsou navázány na povrch červených krvinek. Odebraný vzorek krve je zpracován tak, že přítomné červené krvinky jsou promyty (čímž se odstraní pacientova plazma) a následně se inkubují s protilátkami proti lidským imunoglobulinům (Coombsovo reagens). Pokud dojde k viditelné aglutinaci červených krvinek, přímý Coombsův test je považován za pozitivní, což je důkazem, že protilátky či proteiny komplementu jsou navázány na povrch erytrocytů. Precipitace v tekutém prostředí -využívá se efekt, že při reakci Ag-Ab vzniká zákal – precipitát, jehož intenzita je při konstantním množství přidané protilátky úměrná přidané koncentraci vyšetřovaného antigenu • -měření intenzity zákalu – nefelometrie, turbidimetrie • -obě metodiky umožňují kvantitativní stanovení obsahu proteinů ve vzorku odečtem z kalibrační křivky • Nefelometrie a turbidimetrie •reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem •koncentrace příslušného Ag je úměrná rychlosti tvorby zákalu nebo hustotě zákalu •stanovení sérových bílkovin •měření probíhá v tekutém prostředí v měřící kyvetě (pufr, látka urychlující reakci, Ag, Ab) •množství vytvořených komplexů je p.ú.konc. Ag Nefelometrie -hodí se pro nižší koncentrace Turbidimetrie - hodí se pro koncentrovanější roztoky viditelné světlo viditelné světlo detektor je ve směru kolmém na vstupující paprsek měří množství světla rozptýleného při průchodu paprsku (množství světla odraženého od vznikajících komplexů) detektor je v ose paprsku měří množství procházejícího světla (úbytek intenzity světla, které prošlo roztokem v kyvetě) Precipitace v tekutém prostředí: nefelometrie je 5-10x citlivější a nákladnější než turbidimetrie Precipitace v gelu -agaróza, agar -umožňují detekci • precipitačních linií • •- je založena na pasivní difuzi látek v prostředí koncentračního gradientu • • File:Antigen excess.jpg http://www.wikilite.com/wiki/index.php/File:Antigen_excess.jpg - Ag i Ab difundují v prostředí gelu a v místě, kde konc. Ag i Ab dosáhnou optimílního (ekvimolárního) poměru vzniká precipitát Podle počtu difundujících reaktantů: •jednoduchá radiální imunodifúze -koncetrační gradient jednoho z reaktantů (většinou Ag) -druhý reaktant (většinou Ab) - rovnoměrně rozptýlen ve struktuře gelu -výsledkem jsou ostře ohraničené kroužky precipitátu -plocha prstence - p.ú. konc. vyšetřovaného Ag -podle konc. standardu – kalibr. křivka - • • •dvojitá radiální imunodifúze (podle Ouchterlonyho) -testování více materiálů -gradient vytváří jak Ag, tak Ab a dochází k protisměrné difúzi obou reaktantů (radiálně) -v zóně ekvivalence – precipitační linie, která ukazuje na pozitivitu reakce -hodnocení - kvalitativní http://www.immy.com/products/immunodiffusion/ Imunodifise I Imunodifuse II Imunodifuse III Kalibrační křivka – charakterizuje vztah mezi koncentrací vyšetřované látky a např. průměrem kruhů na příslušné vyšetřovací desce Komplementfixační reakce (KFR) •imunologická metoda patřící mezi základní serologické metody, jež fungují na principu reakce protilátky s antigenem, využívá schopnosti komplementu vázat se na komplex antigenu s protilátkou • •využívá se např. k průkazu protilátek proti původcům respiračních infekcí a řady virových onemocnění • •lze použit k identifikaci jak specifických protilátek tak antigenu • •reakce se hodnotí v několika ředěních séra, jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze • http://www.virion-serion.de/uploads/mit_download/CFT-V9-CZ.pdf Neutralizační reakce •testované sérum se smíchá s kulturou konkrétního viru a nechá se inkubovat –obsahuje-li testované sérum protilátky proti tomuto viru, dojde k vazbě protilátek na receptory viru a jeho inaktivaci –neobsahuje-li sérum protilátky virus zůstane aktivní •inkubovaným roztokem se poté naočkuje buněčná kultura –v pozitivním případě (sérum obsahuje protilátky proti viru) inaktivovaný virus není schopen napadnout buňky a nedojde k vytvoření cytopatického efektu –je-li sérum negativní, na buněčné kultuře je pod mikroskopem patrný cytopatický efekt •metoda se obvykle provádí v několika ředěních séra, jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (tzv. titr, tradičně ve formě 1:xxx) při kterém ještě nedošlo k cytopatickému efektu či onemocnění (uhynutí) zvířete Neinfikováno virem Infikováno virem http://www.cdc.gov/ncidod/eId/vol11no02/04-1016.htm senzitivita a specifita •Senzitivita je definována jako pravděpodobnost, že test bude pozitivní u nemocných • • • • •Specificita je definována jako pravděpodobnost, že test je negativní u osob bez nemoci {\rm specificity}=\frac{\rm number\ of\ True\ Negatives}{{\rm number\ of\ True\ Negatives}+{\rm number\ of\ False\ Positives}} Pravdivě pozitivní: Nemocný je správně identifikován jako nemocný Falešně pozitivní: Zdravý je nesprávně identifikován jako nemocný Pravdivě negativní: Zdravý je správně identifikován jako zdravý Falešně negativní: Nemocný je nesprávně identifikován jako zdravý.