Proliferace lymfocytů O.Tichá, FNusA Izolace lymfocytů •10 ml krve – pro čtyři studenty •10ml krve smíchat s 10 ml RPMI v kontejnerku, promíchat •do prázdné zkumavky napipetovat 3,5 ml Lymphoprepu •pasterkou nanést OPATRNĚ na povrch Lymphoprepu cca 5 ml krve smíchané s RPMI (ve skupině 4 rovnoměrně = stejná hladina), vrstvy se nesmí promíchat •stáčet při 2500 ot. /30 min •po centrifugaci: bílý proužek cca uprostřed je vrstva lymfocytů oddělený na základě odlišné vznášivé hustoty •odstranit do koše vrchní vrstvu krevní plazmy •kroužek lymfocytů přenést do nové zkumavky (vždy 2 studenti do 1 zkumavky) •doplnit do plného objemu PBS a PROMÍCHAT pasterkou •centrifugovat 1800 ot./10 min Izolace lymfocytů 2 •zkontrolovat zda jsou lymfocyty zcentrifugovány na dně zkumavky •slít tekutinu •přidat 1 ml PBS •dobře promíchat •nechat spočítat lymfocyty pomocí přístroje pro počítání leukocytů – naměřená hodnota udává počet lymfocytů x106/ml Izolace lymfocytů 3 Kultivace lymfocytů in vitro •primární buněčné linie lymfocytů jsou odvozené z periferní krve nebo z lymfoidních orgánů •pouze model chování IS – IS je jinak velice komplexní!! •pěstování probíhá v definovaném bazálním médiu – obsahuje cukry, AMK, vitamíny, stopové prvky atd. (+ATB-penicilin, streptomycin…) při 37°C, 5%CO2, 95%vlhkost •podle typu pěstovaných buněk další přídavné látky (některé připraveny pomocí GI) •cesta kterou objeveny mnohé fce cytokinů a růst. faktorů •normální buňky mají omezenou délku života – omezený počet dělení •pro srovnání experimentálních dat problém → pomocí karcinogenních látek či virů (SV40, EBV) lze dosáhnout transformace buněk na nesmrtelné a vytvořit tzv. buněčné linie • Jurkat – lidské leukemické buňky produkující IL-2 • HL-60 – lidské buňky odvozené od myeloidních leukemických bńěk Kultivace lymfocytů in vitro 2 Proliferační test •testuje schpnost lymfoyctů dělit se po stimulaci •k testu se využívá: plné periferní krve nebo izolovaných leukocytů •je potřeba definované množství lymfocytů •přidá se stimulancium (PHA, ConA, Ag…) •inkubace 2 (ConA, PHA) či 7 (tetanický toxoid) dní •den před vyhodnocováním testu se přidá do proliferační směsi tymidin s H3 •druhý den se hodnotí množství začleněného tymidinu pomocí betacounteru (jednotky cpm) SCID severe combined imunodeficiency •skupina onemocnění, které vykazují vadu ve vývoji lymfoidní řady – někdy pouze porucha vývoje T-lymf, někdy kombinace s B-lymf. a s NK buňkami (záleží na genetické vadě) •klinické projevy - nevyvíjí se thymus, velmi nízké počty cirkulujících lymfocytů (lymfopenie) a T-lymfocytů • lymfocyty nereagují na stimulaci mitogeny – tzn. nemůžou proliferovat v odpovědi na antigeny • (myeloidní a erytroidní řada je v počtech a funkci neovlivněna) SCID •existuje asi 7 variant, které jsou AR, jedna X vázaná •většinou jde o defekt v gama řetězci IL-2R (X-vázaná forma), tento řetězec je součástí i receptorů IL-4, -7, -9, 15 • SCID •prodloužení života vyhnutím se kontaktu s potenciálně nebezpečnými patogeny – musí žít ve sterilním prostředí! •musí se vyhýbat kontaktu s lidmi a nefiltrovaným vzduchem, vše s čím přijdou tyto děti do styku - včetně jídla! musí být sterilizováno • ELISPOT •umožňuje kvantifikaci buněk v populaci, které produkují specifické protilátky proti předloženému antigenu ELISPOT •5 x 105 •2,5 x 105 •1,25 x 105 •0,63 x 105 7 dní po očkování