Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinická cytogenetikaKlinická cytogenetika Hanáková M. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno DEFINICE A HISTORIEDEFINICE A HISTORIE • klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromosomů (jejich počtem a morfologií), jejich segregací v meióze a mitóze a vztahem mezi nálezy chromosomových aberací a fenotypovými projevy. • vznik moderní lidské cytogenetiky se datuje od roku 1956, kdy Tjio a Levan vyvinuli efektivní metodiky analýzy chromosomů a stanovili, že normální počet lidských chromosomů je 46. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SCHEMA LIDSKÉ BUŇKYSCHEMA LIDSKÉ BUŇKY buněčné jádro cytoplasma s organelami Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno DEFINICE KLINICKÉ CYTOGENETIKY DEFINICE KLINICKÉ CYTOGENETIKY chromosomy = spiralizované molekuly DNA počet chromosomů člověka = 46 (metafáze mitózy) DNA rozptýlená v buněčném jádře (interfáze) interfáze (G1, S, G2 fáze) mitóza buněčný cyklus Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromosomů CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromosomů během buněčného cyklu se chromatin nachází v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký stupeň spiralizace, během mitózy postupná kondenzace, maximální v metafázi mitózy) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOM lineární struktura CHROMOSOM lineární struktura metafázní chromosom s G – pruhy – skládá se ze sesterských chromatid přiložených těsně k sobě Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADERNÝ MATERIÁLJADERNÝ MATERIÁL • chromatin – komplex DNA s chromosomovými proteiny a RNA (pojem používaný pro interfázi buněčného cyklu) • chromosom – chromatin spiralizovaný v mitóze • chromatida = 1 kontinuální molekula dvouvláknové DNA ve vazbě s chromosomovými proteiny (spiralizovaná v mitóze) Jestliže chceme vysledovat osud chromatid chromosomu v interfázi, hovoříme o "chromatidách" i v despiralizované podobě. Chromosom se skládá z 1 nebo 2 chromatid (v různých fázích spiralizace) v závislosti na fázi buněčného cyklu. pojmy chromatin a chromosomy - týkají se téhož jaderného materiálu, odlišnost ve stupni spiralizace v závislosti na fázi buněčného cyklu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMCHROMOSOM • centromera = heterochromatinová oblast (konstitutivní heterochromatin), místo rozdělení krátkých a dlouhých ramének, místo spojení sesterských chromatid, místo tvorby kinetochorů v meióze a mitóze, (primární konstrikce, zaškrcení) • telomera = specifická DNA sekvence na koncích každého chromosomu (každé chromatidy, dvoušroubovice DNA), která zajišťuje integritu chromosomu během buněčného dělení (repetitivní hexamer (TTAGGG)n) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY - KARYOTYPCHROMOSOMY - KARYOTYP • karyotyp = utříděný a zhodnocený soubor chromosomů v somatických buňkách pacienta, v zápisu označujeme počet chromosomů, typ pohlavních chromosomů a případné aberace (zápis karyotypu např. 46,XY) • normální lidský karyotyp se skládá ze 46 chromosomů, z toho 22 párů autosomů (nepohlavních chromosomů) a 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) • chromosomový pár je tvořen homologními chromosomy, z nichž jeden je zděděn od otce a druhý od matky, nepárové chromosomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) chromosomový pár (homologní chromosomy) obrázek karyotypu = utříděný a zhodnocený soubor chromosomů jedné buňky, který charakterizuje i chromosomy v ostatních buňkách pacienta ve vyšetřované tkáni Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÁPIS KARYOTYPUZÁPIS KARYOTYPU 46,XX - normální ženský karyotyp 46,XY - normální mužský karyotyp počet chromosomů v jádrech buněk jedince pohlavní chromosomy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery • metacentrické chromosomy centromera téměř nebo úplně uprostřed, tedy krátká a dlouhá raménka jsou (téměř) stejně dlouhá • submetacentrické chromosomy centromera mimo střed chromosomu, p a q raménka jsou jasně délkově odlišena Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery • akrocentrické chromosomy centromera je umístěna velmi blízko jednomu konci; od krátkých ramének jsou odškrceny satelity (malé výrazné části chromatinu; místo odškrcení = sekundární konstrikce (tenké stopky); (sekundární konstrikce obsahuje kopie genů kódujících rRNA = organizátor jadérka) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY třídění chromosomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY CHROMOSOMY třídění chromosomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY Obr. 12 (Dokumentace OLG FN Brno) Pohlavní chromosomy: - chromosom X – podle velikosti a polohy centromery lze zařadit do skupiny C - chromosom Y – velikostně se nejvíce blíží chromosomům skupiny G. Významný rozdíl mezi chromosomy 21, 22 a chromosomem Y je však ten, že chromosomy skupiny G jsou akrocentrické a chromosom Y submetacentrický Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADÉRKOJADÉRKO • difuzní struktura v jádře, která není ohraničena membránou • dochází v ní k syntéze podjednotek ribosomů (ribosomy – bílkovinné struktury, které se účastní syntézy bílkovin v cytoplazmě) – geny pro syntézu lokalizovány v oblasti sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů • je přítomno v interfázním jádře, mizí v mitóze jaderná membrána jadérko Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADÉRKOJADÉRKO přítomnost jadérka v interfázním jádře a jeho nepřítomnost v mitóze souvisí se spiralizací a despiralizací akrocentrických chromosomů jadérko 10 dekondenzovaných akrocentrických chromosomů v interfázi, jejich chromatinové smyčky, které obsahují geny pro rRNA (sekundární konstrikce) se shlukují a tvoří základ jadérka jaderná membrána interfázní jádro mitóza spiralizované akrocentrické chromosomy, každý má spiralizovanou svou chromatinovou smyčku, která tvoří sekundární konstrikci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKYMETODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • odběr materiálu • kultivace • zpracování suspenze • pruhování / barvení chromosomů - metody 1. volby v indikovaných případech - relativně levné metody (ve srovnání s metodami molekulární cytogenetiky) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY HISTORIE METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY HISTORIE • vznik moderní lidské cytogenetiky - datuje se od roku 1956, kdy byl stanoven počet lidských chromosomů a byly vyvinuty efektivní metodiky analýzy chromosomů • klasická konvenční metoda barvení chromosomů (chromosomy obarveny po celé délce – lze třídit chromosomy podle velikosti a polohy centromery) • pruhovací metody (1968-70) (proužky na chromosomech, které umožňují individuální rozlišení jednotlivých chromosomů a chromosomových změn) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu Odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) • do heparinu a transportního média – kostní dřeň (obv. 1-2 ml) • do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda (obv. 20 ml) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních chromosomů : • periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty • fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé T-lymfocyty • plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní fibroblasty • choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových klků nebo placenty • kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní fibroblasty • kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk • solidní tumory – z nádoru – maligní buňky Pro nasazení do kultivačního média neizolujeme jen určitý typ buněk, ale nasazujeme plný materiál se všemi typy buněk. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu odebrané choriové klkyodebraná periferní krev odběr plodové vody Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • délka kultivace - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) - 48 hodin (stanovení ZCA) kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci chromosomů nebo k zániku buněk s aberací - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) - kostní dřeň – přímé zpracování buněk ihned po odběru - 24 hodin (48 hodin spec. případy) (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) - solidní tumory – 1 týden (stanovení karyotypu maligních klonů v tumoru) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • kultivace buněk v suspenzi (periferní krev, fetální krev, choriové klky, kostní dřeň) • kultivace buněk přichycených na dně kultivační nádobky (plodová voda, solidní tumory, kůže) - po kultivaci pomocí roztoku trypsinu odloupneme ode dna, dále zpracováváme jako suspenzi buněk kultivace plodové vody kultivace periferní krve Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve • kultivace periferní krve v médiu s přídavkem phytohemaglutinu (PHA) = výtažek z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. jádra vstupují do mitózy!) (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, dělí se samovolně) - význam kultivace – spiralizace chromosomů v jádrech T-lymfocytů - složení kultivačního média – živné látky, antibiotikum, PHA, stabilizátor pH Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - kolchicin je mitotický jed, který specificky inhibuje tvorbu dělícího vřeténka a tím zastavuje dělení jader v metafázi mitózy, kdy jsou chromosomy vhodné k analýze Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • hypotonizace lýza erytrocytů, zvětšení objemu buněk, rozestoupení chromosomů v důsledku působení roztoku KCl přídavek roztoku KCl inkubace hypotonizační směsi v termostatu 37°C Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • fixace – získání suspenze - kyselina octová (1) : metanol (3) - usmrcení buněk, zviditelnění struktury a zlepšení barvitelnosti chromosomů, rozrušení cytoplasmy buněk , rozpuštění nečistot Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • vykapání suspenze na podložní sklíčka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G - pruhování chromosomů 2 – barvení barvivem Giemsa – Romanowski - A A 1 - inkubace preparátu v roztoku enzymu trypsinu (natrávení chromosomových proteinů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY chromosomy s G-pruhy METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY chromosomy s G-pruhy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů • konvenční barvení chromosomů (srovnání s postupem při přípravě chromosomů s G – pruhy – mitózy na sklíčcích po zaschnutí obarvíme v barvě Giemsa-Romanowski bez předchozí inkubace v roztoku trypsinu) 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski chromosomy homogenně obarvené po celé délce, bez příčných pruhů Obr. 9 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů • pruhovací metody umožňují individuální diferenciaci jednotlivých chromosomů (byly zavedeny v letech 1968 -71) • do té doby bylo možné pouze obarvit chromosomy barvivem – orcein, karbolfuchsin, Feulgenovo barvivo a seřadit je do skupin podle velikosti a poměru krátkých a dlouhých ramének • ke klasifikaci chromosomů byl mezinárodně přijat jednotný systém, který vychází z identifikace lidských chromosomů pruhovacími a barvícími postupy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování chromosomu č. 1 – vzor a reálné chromosomy zkracování (spiralizace) chromosomu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů pruhy na každém raménku jsou očíslovány vzestupně od centromery k telomeře číslování pruhů na chromosomech s G-pruhy číslo pruhu umožňuje jednoznačnou identifikaci každého pruhu 1.rozpruhování 2.rozpruhování 3.rozpruhování s postupnou kondenzací chromosomu se zmenšuje počet pruhů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY význam pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY význam pruhování chromosomů 46,XX,t(1;15)(q12;q22) definován přesný rozsah a lokalizace abnormality • rozeznáme chromosomy podobné morfologie (specifické pruhy každý chromosom) • lze zkontrolovat genetický materiál chromosomu po celé délce • zápis strukturních přestaveb – v zápisu strukturní přestavby jsou uvedena čísla pruhů na ramenech chromosomů, které vstoupily do přestavby, ve kterých došlo ke zlomu. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů G – pruhování • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromosomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromosomové proteiny • chromosomy obarvíme Giemsovým barvivem (směs barviv) • výsledek – každý chromosom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohaté na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) • získané pruhy jsou specifické pro každý chromosomový pár • lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality • 1 pruh na chromosomu obsahuje 50 i více genů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální ženský karyotyp 46,XX METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G – pruhování chromosomů normální ženský karyotyp 46,XX Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Q - pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY Q - pruhování chromosomů • barvení akridinovými deriváty (fluoreskující látky – fluorochromy), akridin se specificky váže na oblasti bohaté na adenin (A) a tymin (T) • Q - pruhy (světlé a tmavé), přibližně odpovídají G - pruhům • nevýhody – je třeba speciální fluorescenční mikroskop a při delší expozici UV světlem fluorescence slábne Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY R - pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY R - pruhování chromosomů • vystavení chromosomů působení specifických vlivů před obarvením (zahřátí) • R = reverse (opačný), tzn. R – pruhy jsou opačné ke G - a Q – pruhům (kde jsou G – a Q – pruhy světlé, tam jsou R – pruhy tmavé a opačně) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY C – barvení chromosomů vizualizace konstitutivního heterochromatinu (konstitutivní heterochromatin v oblasti centromer a na dlouhých raméncích některých chromosomů – 1q, 9q, 16q, Yq) - metoda založena na denaturaci DNA působením různých agens (HCl, Ba(OH)2) a následné reasociaci v teplém pufru Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY NOR – barvení chromosomů • navázání zrn stříbra na aktivní oblast organizátoru jadérka (sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů) • stříbro se vyloučí z AgNO3 za vyšší teploty a v kyselém prostředí • zjišťujeme, jestli jsou satelity schopny aktivity (jestli na nich není navázán euchromatin, který by aktivitě bránil a mohl by být nebalancovaným materiálem v karyotypu) • každý akrocentrický chromosom nemusí být aktivní ve všech buňkách Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení Chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení přibližně 1000x za použití imerzních objektivů. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení zvětšení 100 - 200x vyhledávání mitóz zvětšení přibližně 1000x hodnocení Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení světelný mikroskop s CCD kamerou napojený na počítač Ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu Lucia. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotyp setříděný a upravený pomocí počítačového programu Lucia Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY Viz samostatná prezentace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍTYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (VCA) – prenatální a postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (ZCA) (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření IHOK FN BRNOIHOK FN BRNO - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů OLG FN BRNOOLG FN BRNO OLG FN BRNOOLG FN BRNO Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) • významně se podílejí na mnoha případech poruch reprodukce, vrozených malformací, mentálních retardací • cytogenetické poruchy jsou přítomny přibližně u 0,6% živě narozených dětí STANOVENÍ KARYOTYPU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ • postnatální materiály: periferní krev • prenatální materiály: plodová voda, choriové klky, krev plodu, kůže potracených plodů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) • vyšetření chromosomů – metodami klasické cytogenetiky (G-pruhování chromosomů) vyšetření celého karyotypu (všech chromosomů) rozlišovací schopnost nejnižší (do10 Mb – přibližně 1 pruh) • vyšetření chromosomů, interfázních jader i izolované DNA - metodami molekulární cytogenetiky (vyšetření pomocí fluorescenčně značených sond, PCR) vyšetření celého karyotypu vyšetření konkrétních oblastí rozlišovací schopnost vyšší (až po rozdíly v jednotlivých nukleotidech – závisí na konkrétní metodě) • vyšetření izolované DNA - metody molekulární genetiky rozlišovací schopnost nejvyšší (rozdíly v sekvenci DNA) dvoušroubovice DNA chromosom s fluorescenčně značenými sondami (vlevo), interfázní jádro (vpravo) chromosom s G-pruhy Obr. 3 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 2 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 4 (Rosypal, 1989), upraveno Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MEIÓZAMEIÓZA • typ buněčného dělení, při kterém z diploidních zárodečných buněk (primárních oocytů a primárních spermatocytů) vznikají haploidní gamety z 1 diploidní zárodečné buňky vzniknou 4 haploidní gamety chyby během procesu meiózy souvisí se vznikem chromosomových aberací Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MEIÓZAMEIÓZA Např. vznik početních aberací - aneuploidií – patologických chromosomových změn v důsledku chybného rozchodu chromosomů v anafázi meiózy I nebo II Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno PORUCHY V MEIÓZEPORUCHY V MEIÓZE • meiotická nondisjunkce - porucha rozchodu páru chromosomů v anafázi meiózy I nebo II (většinou v průběhu meiózy I) • důsledkem nondisjunkce je aneuploidie – abnormální počet chromosomů v chromosomovém páru v karyotypu, který je způsoben absencí chromosomu nebo přítomností nadbytečného chromosomu • oba chromosomy v páru v anafázi meiotického dělení přemístí ke stejnému pólu místo aby segregovaly k opačným pólům v karyotypu, • nejčastější mutační mechanismus našeho druhu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno PORUCHY V MEIÓZEPORUCHY V MEIÓZE Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů • abnormality počtu chromosomů - polyploidie – počet chromosomů je více než dvojnásobkem haploidního počtu (n = 23) (triploidie 3n= 69, tetraploidie 4n = 92) většinou pouze u plodů (samovolné aborty) - aneuploidie – nejčastější a klinicky velmi významný typ chromosomových poruch - abnormality počtu chromosomů v páru - tento stav je vždy spojen s poruchou fyzického nebo mentálního vývoje Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie • trisomie – nejčastější porucha (přítomnost nadbytečného chromosomu v páru) trisomie autosomů (trisomie celého chromosomu je jen vzácně slučitelná se životem) - Downův syndrom 47,XX,+21/47,XY,+21 - Edwardsův syndrom 47,XX,+18/47,XY,+18 - Patauův syndrom 47,XX,+13/47,XY,+13 trisomie gonosomů (fenotypové důsledky jsou méně závažné než u trisomie autosomů) - Klinefelterův syndrom 47,XXY (muž) - další syndromy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Downův syndrom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Downův syndrom Downův syndrom 47, XX, +21 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Edwardsův syndrom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Edwardsův syndrom Edwardsův syndrom 47,XY,+18 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Patauův syndrom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Patauův syndrom Patauův syndrom 47,XY,+13 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Klinefelterův syndrom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Klinefelterův syndrom Klinefelterův syndrom 47,XXY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie • monosomie – méně častá porucha (chybění chromosomu v páru) - monosomie gonosomu X (Turnerův syndrom) 45,X (žena) častý výskyt - monosomie autosomů – výjimečně se vyskytující porucha, slučitelná se životem jen u některých chromosomů a to v mozaice (v těle jedince mohou být přítomny 2 nebo více buněčné linie s různou chromosomovou sestavou, např. linie normální s linií s monosomií chromosomu č.18) 45,XX,-18[10]/46,XX[190] Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Turnerův syndrom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Turnerův syndrom Turnerův syndrom 45,X Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • strukturní abnormality chromosomů • méně časté než aneuploidie • dochází k přestavbám a následně ke změnám morfologie chromosomů • předpokladem je vznik zlomů na chromosomech • strukturní abnormality se vyskytují přibližně u 1:375 novorozenců • k chromosomovým změnám dochází spontánně nebo mohou být vyvolány působením faktorů, které zlomy způsobují Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • méně časté než aneuploidie • změna struktury chromosomů • podmínkou je vznik zlomů na chromosomech • metodami klasické cytogenetiky (ve světelném mikroskopu) lze na chromosomech rozlišit pouze strukturní změny o určité velikosti (>5Mb) • změny menší lze detekovat metodami s vyšší rozlišovací schopností – metodami molekulární cytogenetiky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • balancované přestavby - v sadě chromosomů je zachováno normální množství chromosomového materiálu - většinou nemají fenotypové vyjádření, v buňkách je přítomen veškerý chromosomový materiál, i když v odlišném uspořádání - mohou mít fenotypové vyjádření v případě, že jsou v důsledku přestavby vyřazeny některé geny z funkce, v místě zlomu vznikla malá delece, která není detekovatelná ad. (zdánlivě balancovaná chromosomová přestavba) • nebalancované přestavby – část chromosomového materiálu v karyotypu chybí (parciální monosomie) a (nebo) část přebývá (parciální trisomie), v některých případech může být v karyotypu přítomna kombinace těchto změn - většinou dochází k fenotypovým abnormalitám Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace – balancovaná přestavba VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace – balancovaná přestavba • translokace – nejčastější ze strukturních aberací, předpokladem je vznik dvou zlomů, každý na jednom chromosomu reciproké translokace – výměny chromosomových segmentů mezi dvěma, zpravidla nehomologními, chromosomy robertsonovské translokace – 2 akrocentrické chromosomy fúzují v oblasti centromery a ztrácejí svá krátká raménka (ztráta nemá vliv na fenotyp), vznik zlomů v oblasti centromery reciproké translokace se vyskytují s frekvencí přibližně 1:600 novorozenců Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace reciproká translokace t(1;15) výměna koncových úseků chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby reciproká translokace t(1;15) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby reciproká translokace t(1;15) 46,XX,t(1;15)(q12;q22) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace robertsonovská translokace der(13;14) (derivovaný chromosom) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby robertsonovská translokace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby robertsonovská translokace 45,XX,der(13;14)(q10;q10) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokační forma Downova syndromu VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokační forma Downova syndromu 45,XX,der(21;21)(q10;q10) 46,XY,der(21;21)(q10;q10),+21 rodič dítě Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokační forma Downova syndromu VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokační forma Downova syndromu 45,XX,der(14;21)(q10;q10) 46,XY,der(14;21)(q10;q10),+21 rodič dítě Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) důsledek přítomnosti translokace u rodiče – riziko nebalancovaného karyotypu u potomka VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) důsledek přítomnosti translokace u rodiče – riziko nebalancovaného karyotypu u potomka translokace u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet s tím spojených abortů nebo narození potomků s nebalancovaným karyotypem (parciální monosomie jednoho a parciální trisomie druhého chromosomu) karyotyp matky 46,XX,t(16;21) chromosomy, které se zúčastnily translokace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace 46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1)mat rodič dítě Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze • inverze – na jednom chromosomu vzniknou 2 zlomy, segment mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení do chromosomu paracentrická inverze – oba zlomy jsou na stejném raménku, úsek nezahrnuje centromeru pericentrická inverze – na každém raménku je jeden zlom, invertovaný úsek zahrnuje centromeru Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze pericentrická inverze inv(8) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze 46,XX,inv(8)(p23.1?q23?) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze paracentrická inverze inv(1) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze 46,XX,inv(1)(q21q32) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) důsledek přítomnosti inverze u rodiče – riziko nebalancovaného karyotypu u potomka VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) důsledek přítomnosti inverze u rodiče – riziko nebalancovaného karyotypu u potomka inverze u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s rizikem vzniku nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece – aberace způsobující nebalancovaný karyotyp (vznik de novo) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece – aberace způsobující nebalancovaný karyotyp (vznik de novo) • delece – vznik zlomů a ztráta úseku chromosomu, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální monosomie) terminální delece –vznik jednoho zlomu, ztráta koncového úseku chromosomu intersticiální delece –vznik dvou zlomů, ztráta segmentu uloženého mezi centromerou a terminální částí incidence cytogeneticky pozorovatelných delecí je asi 1:700 živě narozených dětí Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece terminální delece del (5p) syndrom Cri du chat (syndrom kočičího křiku) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece 46,XX,del(5p)(p14.1) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce – balancovaná přestavba VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce – balancovaná přestavba • inzerce – nereciproký typ translokace - segment z jednoho chromosomu je odstraněn a vložen do jiného chromosomu buď ve své původní orientaci nebo opačné - k jejich vzniku jsou potřeba 3 body zlomu, 2 na jednom chromosomu a 1 na druhém - jsou poměrně vzácné (1:80000) - hrozí vznik nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce inzerce úseku chromosomu č. 14 do chromosomu č. 6 příklad zdánlivě balancované přestavby karyotyp probanda 46,XY,ins (6;14), de novo Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce 46,XY,ins(6;14)(p24;q13q22) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace – aberace způsobující nebalancovaný karyotyp (vznik de novo) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace – aberace způsobující nebalancovaný karyotyp (vznik de novo) • duplikace – nadbytečný chromosomový segment, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální trisomie) - bývají méně nebezpečné než delece - vznik v důsledku nerovnoměrného crossing overu duplikace segmentu dup(6) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace 46,XX,dup(6)(q22q23) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromosomů VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromosomů marker chromosomy – malé chromosomy (s centromerou), často v mozaice, obtížně identifikovatelné (mohou být vrozené nebo kultivačního původu) kruhové chromosomy (ring chromosomy) – na obou koncích chromosomu vzniknou zlomy, dojde ke ztrátě koncových úseků, zbytek chromosomu se spojí - jsou poměrně vzácné, ale byly zjištěny u všech lidských chromosomů marker chromosomy představují nadbytečný genetický materiál v karyotypu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby ring chromosom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby ring chromosom 46,XX,r(18) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby marker chromosom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby marker chromosom 47,XX,+mar Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromosomů VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromosomů • izochromosomy – metacentrické chromosomy, jejichž 1 raménko chybí a druhé je duplikováno (parciální monosomie 1 raménka a parciální trisomie 2. raménka) podstata tvorby izochromosomu není přesně známa, jsou popsány alespoň 2 mechanismy: - porucha dělení centromery (příčné), následné dosyntetizování celého raménka v S fázi buněčného cyklu - výměna celého raménka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby izochromosom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby izochromosom 46,X,idic(Xq) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromosomů VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromosomů • dicentrické chromosomy - na dvou chromosomech dojde ke zlomu - vznikne dicentrický chromosom fúzí úseků s centromerou a acentrický fragment spojením úseků bez centromery „C“ barvením prokázána přítomnost 2 centromer Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby dicentrický chromosom VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby dicentrický chromosom 46,XY,dic(13;14)(q11;q11) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÁPIS KARYOTYPUZÁPIS KARYOTYPU 47,XX,+18 46,XX,t(8;21)(p11.2;q22.3) nadbytečný autosom v jádrech buněk (početní změna) 45,X 47,XXY chybějící nebo nadbytečný gonosom v karyotypu (početní změna) translokace v karyotypu (strukturní změna), ve druhé závorce zápis bodů zlomů na chromosomových raméncích podle cytogenetické nomenklatury 45,X[12] / 46,XX[188] mozaika gonosomů – více (minimálně dvě) buněčné linie v karyotypu Příklady patologických karyotypů: Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS • má – li osoba chromosomovou abnormalitu, bývá většinou aberace přítomna ve všech jejích buňkách • mozaicismus = v těle jedince jsou přítomny 2 nebo více linie buněk s odlišnou chromosomovou konstitucí - nejčastější výskyt mozaiky gonosomů 45,X[6]/47,XXX[4]/46,XX[190] - mozaika autosomů mozaika linie s normálním karyotypem s linií s Downovým syndromem 46,XY[28]/47,XY,+21[172] • ve formě mozaiky mohou být přítomny numerické aberace i strukturní přestavby, početní se vyskytují častěji • nejčastější příčinou mozaicismu je nondisjunkce v časném postzygotickém mitotickém dělení (např. ztráta chromosomu č.21 z buňky zygoty s trisomií tohoto chromosomu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS • je obtížné posoudit význam nálezu mozaiky - záleží na typu chromosomové abnormality - význam má % zastoupení linie s patologickým karyotypem - mozaika může být zastoupena v různých tkáních v různé míře • riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu (zejména prenatální diagnostika), potíže při interpretaci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k postnatálnímu stanovení karyotypu (VCA) Klinické indikace k postnatálnímu stanovení karyotypu (VCA) • problémy časného růstu a vývoje neprospívání, opoždění vývoje, dysmorfická facies, mnohočetné malformace, malá postava, obojetný genitál, mentální retardace • narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence výskyt chromosomových abnormalit je vyšší u případů narození mrtvého plodu (téměř 10%) než u živě narozených dětí (asi 0,7%), zvýšený výskyt také u dětí, které umírají v novorozeneckém období (okolo 10%) • problémy s fertilitou ženy s amenoreou, infertilní páry, opakované spontánní aborty, partneři před IVF • rodinná anamnéza známá nebo suspektní chromosomová abnormalita u příbuzných • dárci gamet, děti k adopci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Prenatální diagnostika (součástí je invazivní prenatální diagnostika, při které analyzujeme karyotyp plodu) Prenatální diagnostika (součástí je invazivní prenatální diagnostika, při které analyzujeme karyotyp plodu) Viz samostatná přednáška Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika AMC – odběr plodové vody – přítomnost pravého mozaicismu u plodu (v těle plodu jsou přítomny 2 nebo více buněčných linií, jejichž karyotyp je odlišný) např. 47,XX,+21 [35] / 46,XX [65] – riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu (kultivační artefakt) (např. přítomnost nadbytečného chromosomu nebo strukturní přestavby v 1 mitóze) vyloučení kultivačního artefaktu - kultivace 2 paralelních kultur z AMC - opakovaný odběr (AMC, CVS) - riziko kontaminace mateřskou krví při odběru - po kultivaci nemůže ovlivnit výsledek karyotypu plodu, protože buňky mateřské krve se nenakultivují v médiu specifickém pro kožní fibroblasty, (ale může ovlivnit výsledek analýzy metodou PCR – izolovaná DNA je směsí DNA kožních fibroblastů plodu a krevních buněk matky) - riziko kontaminace mateřskou tkání při odběru – může ovlivnit výsledek karyotypu plodu, kožní fibroblasty matky i plodu podléhají kultivaci mozaicismus - přítomnost 2 nebo více buněčných linií ve vyšetřované tkáni, které se liší karyotypem - NE VŽDY SE JEDNÁ O PRAVÝ MOZAICISMUS INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY analýza buněk plodu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika – pravý mozaicismus – rozdílný karyotyp u embrya a v extraembryonální tkáni (kromě toho jak u plodu, tak v klcích, může být karyotyp s pravou mozaikou nebo bez mozaiky) - riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu hrozí u dlouhodobě kultivovaných vzorků - při dlouhodobé kultivaci existuje riziko vzniku pseudomozaiky způsobené kontaminací mateřskou tkání (pouze u plodů ženského pohlaví) – prevence – pečlivé oddělení mateřské tkáně před kultivací - kontaminace mateřskou krví pro cytogenetické vyšetření nevadí (buňky krve se nenakultivují za podmínek kultivace choriových klků); pro molekulárně genetické vyšetření je kontaminace krví matky na závadu – izolujeme DNA současně z krve i klků – směs DNA plodu a matky) Přibližně 2% vyšetření vzorků z CVS přinášejí nejednoznačný výsledek v důsledku chromosomového mozaicismu (zahrnuje pravý mozaicismus a pseudomozaicismus). V těchto případech je pro potvrzení případné chromosomové aberace doporučeno indikovat AMC. INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY CVS - biopsie choriových klků (chorionic villi sampling) analýza extraembryonální tkáně (plodový obal chorion) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika - je možný rozdílný nález karyotypu embrya a extraembryonální tkáně - riziko, že klky mají normální karyotyp a plod trisomii je minimální - sporné nálezy jsou potvrzovány AMC placentární mozaicismus – možný zdroj falešně pozitivních výsledků pravý mozaicismus u choriových klků INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ VCAVÝZNAM VYŠETŘENÍ VCA - objasnit příčinu zdravotních potíží pacienta - stanovit prognózu onemocnění, nabídnout pacientovi možnosti léčby a péče - prevence výskytu vrozených chromosomových aberací v rodině VCA léčbou nevymizí Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍTYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ – prenatální a postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření IHOK FN BRNOIHOK FN BRNO - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů OLG FN BRNOOLG FN BRNO OLG FN BRNOOLG FN BRNO Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) (vliv mutagenních faktorů prostředí) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) (vliv mutagenních faktorů prostředí) VYŠETŘENÍ % ABERANTNÍCH BUNĚK Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁL K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁL K VYŠETŘENÍ periferní krev Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) • vlivem mutagenních faktorů prostředí dochází na chromosomech ke změnám (zlomy, vznik di-, tricentrických chromosomů, ring chromosomů ad.) – nacházíme různé změny v různých buňkách (v každé buňce může být jiná chromosomová aberace – nejedná se o mozaiku, ale o náhodné změny, v jedné buňce můžeme nalézt 1 změnu nebo i více) (stanovení % aberantních buněk, hraniční patologie – opakovaný nález 5% ab. buněk) dicchrb vyšetření z periferní krve metodou klasické cytogenetiky – konvenční barvení chromosomů Obr. 7 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) • rychlejší stárnutí organismu • vznik degenerativních onemocnění • možné maligní zvrhnutí Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách • zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem hraniční patologie – opakovaný nález 5% aberantních buněk Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku působení - fyzikálních faktorů (ionizující záření) - chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) - biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • jednochromatidové gapy (mezery) – nejsou považovány za patologii (G´nebo chtg – chromatid gap)- příčně slabě se barvící část chromatidy achromatické léze), také úplné přerušení chromatidy nepřesahující její šířku Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • jednochromatidové zlomy (Z´nebo chtb – chromatid brake), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • výměny (V nebo chte – chromatid exchange)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace - výměny ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace - výměny Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • dvouchromatidové zlomy (Z´´nebo chrb – chromosome break), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • izochromatidové gapy (mezery) (G´´nebo chrg – chromosome gap)- příčně slabě se barvící část chromosomu (achromatické léze), také úplné přerušení chromosomu nepřesahující šířku chromatidy nejsou považovány za patologii Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • acentrické ringy, kruhové chromosomyuzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromosomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromosomy zahrnují centromeru Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomy zahrnující více než 1 centromerudicentrické, tricentrické chromosomy… Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) Změny na chromosomech jsou náhodné (v různých buňkách různé), proto identifikujeme pouze typ aberace (např. zlom, ring chromosom aj.) a není třeba aberaci dále analyzovat (například určovat přesně místa zlomů, které chromosomy se spojily v dicentrický chromosom, apod.). Tzn. vyšetřujeme POUZE METODOU KLASICKÉ CYTOGENETIKY – konvenčním barvením chromosomů směsí barviv Giemsa – Romanowski. (netřeba vyšetření molekulárně cytogenetickými metodami) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno POSTUP ZÍSKÁNÍ PREPARÁTUPOSTUP ZÍSKÁNÍ PREPARÁTU • odběr materiálu – STERILNÍ ODBĚR! • kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk (s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem doba kultivace 48 hodin (zachycení 1. buněčného dělení), kratší než u stanovení karyotypu • zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) – získání suspenze buněk • vykapání na podložní sklíčka • barvení chromosomů konvenční metodou • hodnocení ve světelném mikroskopu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů • konvenční barvení chromosomů (srovnání s postupem při přípravě chromosomů s G – pruhy – mitózy na sklíčcích po zaschnutí obarvíme v barvě Giemsa-Romanowski bez předchozí inkubace v roztoku trypsinu) 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski chromosomy homogenně obarvené po celé délce, bez příčných pruhů Obr. 9 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro: 1. stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy - délka kultivace 72 hodin - G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa – Romanowski - nalezenou aberaci se snažíme co nejpřesněji definovat (i za pomoci metod molekulární cytogenetiky) 2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené - délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení – později dochází k opravě aberací) - konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu - konkrétní aberace neupřesňujeme, podstatné je pouze jestli je/není v dané buňce některá aberace přítomna VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) Obr. 18 Reálné chromosomy (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k vyšetření ZCA (mutagenní faktory) Klinické indikace k vyšetření ZCA (mutagenní faktory) • práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením), vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem • po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě • kontrolní vyšetření u podchycených případů Význam vyšetření - aberace vymizí po léčbě vitamíny Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍTYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ – prenatální a postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření IHOK FN BRNOIHOK FN BRNO - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů OLG FN BRNOOLG FN BRNO OLG FN BRNOOLG FN BRNO Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů VYŠETŘENÍ KARYOTYPU MALIGNÍCH KLONŮ Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ kostní dřeň solidní nádory periferní krev Obr. 1 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) • vyšetření chromosomů – metodami klasické cytogenetiky (G-pruhování chromosomů) vyšetření celého karyotypu (všech chromosomů) rozlišovací schopnost nejnižší (do10 Mb – přibližně 1 pruh) • vyšetření chromosomů, interfázních jader i izolované DNA - metodami molekulární cytogenetiky (vyšetření pomocí fluorescenčně značených sond, PCR) vyšetření celého karyotypu vyšetření konkrétních oblastí rozlišovací schopnost vyšší (až po rozdíly v jednotlivých nukleotidech – závisí na konkrétní metodě) • vyšetření izolované DNA - metody molekulární genetiky rozlišovací schopnost nejvyšší (rozdíly v sekvenci DNA) dvoušroubovice DNA chromosom s fluorescenčně značenými sondami (vlevo), interfázní jádro (vpravo) chromosom s G-pruhy Obr. 3 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 2 (Dokumentace OLG FN Brno) Obr. 4 (Rosypal, 1989), upraveno Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮVYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮ vyšetření v laboratořích klasické a molekulární cytogenetiky klasická cytogenetika – kultivace, zpracování vstupních materiálů založeny na obdobných principech - G-pruhování chromosomů molekulární cytogenetika – metoda FISH, SKY, CGH a další metody stanovujeme KARYOTYP MALIGNÍCH KLONŮ – v nádorové tkáni mohou být přítomny skupiny buněk s odlišným karyotypem – klony – v rámci klonu stejný karyotyp Obr. 5 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů • početní abnormality • abnormality počtu chromosomových sad (obv. se nejedná o přesný násobek haploidního počtu) - polyploidie (hypo-, hyper- (di-, tri- atd.) ploidie) • abnormality počtu chromosomů v páru - aneuploidie (trisomie, monosomie)- často se týká jiných chromosomů než u vrozených chromosomových aberací • strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní typy chromosomů – konkrétní aberace odlišné od VCA • amplifikace (mnohonásobné zmnožení onkogenu, detekovatelné cytogeneticky) – pouze u onkologických pacientů – souvisí se vznikem a progresí onkologického onemocnění (poruchy dělení somatických buněk), vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor Obr. 6 (Dokumentace OLG FN Brno) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS • nádorové buňky tvoří klony • klon - skupina geneticky identických buněk – z pohledu cytogenetiky se stejným karyotypem (v nádorové tkáni pacienta se může vyskytovat více buněčných klonů, každý z nich nese jiné aberace) (stanovení karyotypu maligních klonů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů U onkologických pacientů vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením, v souvislosti s onemocněním vznikají chromosomové změny. Cytogenetické vyšetření přesněji charakterizuje nádor, typ nalezených aberací vypovídá o prognóze, fázi onemocnění. Pomáhá zpřesnit diagnózu, stanovit prognózu onemocnění, monitorovat úspěšnost léčby. Cílem je záchrana života pacienta. – některé translokace – vznik fúzních genů, jejichž produkty mají změněnou funkci podporující nebo způsobující nádorové bujení - některé chromosomové změny souvisejí s horší/ lepší/ střední prognózou Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Doporučená literaturaDoporučená literatura • Klinická genetika, Thompson 2001 • Základy klinickej genetiky, Sršeň, Sršňová 1995 • Základy lékařské genetiky, Pritchard, Korf 2003 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Děkuji za pozornostDěkuji za pozornost