Využití molekulárně cytogenetických metod v klinické genetice a onkogenetice Oddělení lékařské genetiky FN Brno Oddělení lékařské genetiky FN Brno Genetická ambulance Laboratoř DNA/RNA diagnostiky Cytogenetické laboratoře l. prenatální cytogenetiky l. onko- cytogenetiky l. molekulární cytogenetiky l. postnatální cytogenetiky OLG FN Brno Laboratoř molekulární cytogenetiky (1998) Samostatné webové stránky: http://www.cba.muni.cz/cytogenlab Společné pracoviště Oddělení genetiky a molekulární biologie, ÚEB PřF MU a Oddělení lékařské genetiky FN Brno 1) specializované molekulárně cytogenetické vyšetření pacientů FN Brno 2) výzkumná činnost 3) vzdělávací činnost Materiál pro molekulární cytogenetické vyšetření periferní krev kostní dřeň vzorky různých tkání buňky plodové vody, choriových klků, placenty pupečníková krev vzorky solidních nádorů klinická cytogenetika nádorová cytogenetika evoluční studie karyotypu studium architektury interfázního jádra mapování lidského genomu genetická toxikologie forenzní genetika analýza virových infekcí Kde všude nám molekulární cytogenetika může pomoci? Rozlišujeme tedy: Základní („klasická“) cytogenetická vyšetření k identifikáci chromozómů a jejich změn je využito hlavně barvících metod (Giemsa, Wright) až na vyjímky je nutné získat chromozómy z metafázních buněk Molekulárně cytogenetická vyšetření identifikují změny chromozómů molekulárně biologickými metodami hybridizace in situ, SKY/mFISH, CGH, PRINS, PCR in situ, MLPA, MAPH k vyšetření většinou stačí jádra interfázních buněk OLG FN Brno OLG FN Brno FISH (fluorescenční in situ hybridizace) r. 1996 detekce balancovaných i nebalancovaných změn r. 2000 CGH/HR-CGH (komparativní genomová hybridizace) detekce nebalancovaných změn v celém genomu CGH (5-10Mb), HR-CGH (do 3Mb) Spektrální karyotypování (SKY) r.2002 detekce balancovaných i nebalancovaných změn v genomu nutnost mitóz Array-CGH r.2008 Agilent´s Human CGH Microarray Kit Detekce nebalancovaných změn v celém genomu MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification) Screening subtelomerových oblastí DiGeorge syndrom Metody využívané na OLG FN Brno OLG FN Brno OLG FN Brno OLG FN Brno FISH = fluorescenční in situ hybridizace 1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení 1986 Pinkel a spol. - fluorescenční značení (FISH) Hybridizace sondy (značené fluorescenčním barvivem) s chromozómy na cytogenetickém preparátu Umožňuje detekci balancovaných i nebalancovaných změn v interfázních buňkách i v mitózách OLG FN Brno FISH Příprava chromozomových preparátů Vyhodnocení na fluorescenčním mikroskopu Značená sonda hybridizovaná s cílovou sekvencí Sonda D e n a t u r a c e H y b r i d i z a c e Značení fluorochromem Cílová sekvence FISH FISH : Typy sond Celogenomové Celochromozomové Centromerické Sondy telomerické, ramenově či pruhově specifické Sondy pro jedinečné sekvence: a) plazmidové (500pb-5 kb) b) kosmidové (20-50 kb) c) bakteriofág lambda (8-15 kb) d) YAC klony (50-1000 kb) Přítomnost, počet a poloha signálů OLG FN Brno OLG FN Brno OLG FN Brno Výhody, nevýhody FISH Výhody nevyžaduje přítomnost mitóz (ve většině případů) rychlé zhodnocení velkého počtu buněk Nevýhody úspěšná hybridizace neposkytuje celogenomový pohled • vyvinuta v roce 1996 • identifikace každého chromozómu pomocí jedinečné kombinace 5 fluorochromů FITC, Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5 •referenční spektra - pseudobarvy, přiřazeny každému chromozómovému páru na základě měření vlnových délek Nevýhody - potřeba kvalitních mitóz - úspěšná hybridizace - finančně nákladné Umožňuje odhalení balancovaných a nebalancovaných ( i kryptických ) přestaveb celého genomu v jednom kroku Spektrální karyotypování SKY 46,XY,del(1p),+del(9p),-20 46,XY,del(1p),der(20)t(17;20) Chlapec, 1 rok, neuroblastom OLG FN Brno OLG FN Brno SKY OLG FN Brno Mnohobarevné pruhování (M-banding) umožňuje během jediné hybridizační reakce stanovit změny vedoucí ke ztrátám či ziskům sekvencí DNA v celém genomu bez ohledu na mitotickou aktivitu buněk Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P. a kol., 1992 potřebný materiál: izolovaná DNA rozlišovací schopnost – 10 Mb klonální zastoupení – 50 % Komparativní genomová hybridizace (CGH) CGH A takto to funguje… www.abbottmoleculars.com www.abbottmoleculars.com CGH A takto to funguje… CGH interpretace výsledků OLG FN Brno CGH interpretace výsledků OLG FN Brno Referenční DNA Testovaná DNA CGH interpretace výsledků enh → zisky, amplifikace dim → ztráty, delece heterochromatin hodnota 1 hranice 0,8 hranice 1,2 č. chromozómu počet hodnocených chromozómů zelená - zisk červená - ztráta výsledný poměr fluorescence CGH interpretace výsledků Ukázka profilu CGH zpracovaného počítačovou analýzou obrazu u pacienta s neuroblastomem rev ish enh (1q21-qter, 2p22-p24, 12q21-qter, 17q21-qter) rev ish dim (1p31-pter, 10q22-qter) enh →→→→ zisky, amplifikácie dim →→→→ straty, delécie OLG FN Brno Výhody a nevýhody klasické CGH? Výhody nevyžaduje mitózy poskytuje přehled numerických změn v celém genomu v jedné hybridizační reakci Nevýhody nemožnost využití u změn, při kterých se nemění počet sekvencí (translokace, inverze) není vhodná k odlišení ploidie (normalizace) možnost identifikovat jen klony přítomné min. v 50 % buněk rozlišovací schopnost 10 Mb HR-CGHCGH rev ish enh (17,Y) rev ish dim (14) rev ish enh (1,2,6,7,12q,17,19,22,Y) rev ish dim (3,4,8,9,10,11,14,15,20,21) neuroblastom OLG FN BrnoOLG FN Brno 46,XX,add(1) děvče, rok narození 2002 dg: stigmata – mongoloidní postavení očí, hyperplastická gingivální sliznice, soudkovitý hrudník, velké rozlité bříško matka 46,XX, inv(9), otec 46,XY,add(1)[87]/46,XY[13] Kazuistika .1 OLG FN Brno CGH: rev ish enh (11p15-pter) – nebalancovaná translokace FISH: der(1)t(1;11) Kazuistika .1 OLG FN Brno Solinas-Toldo a kol., 1997 nahrazení chromozómů separovanými klony BAC, PAC, c-DNA klony, oligonukleotidy ~ 35 kb princíp DNA/DNA hybridizácie, sondy fluorescenčne značené BAC, P1 klony, oligonukleotidy ~ 35 kb Array CGH : ještě větší rozlišení - detekce numerických změn v celém genomu v jedné reakci - přesná lokalizace změn! Array-CGHCGH Array CGH : rozdíl je jen v podkadu Takto to potom vyzerá… Ukážky CGH čipov firmy a) Affymetrix a b) Agilent. a) b) www.abbottmoleculars.com www.affymetrix.com www.agilent.com Array CGH : princip metody www.agilent.com aCGH Analytics Software, Agilent Technologies Array CGH : vyhodnocení OLG FN Brno Trošku viac molekulárnej biológie - MLPA Multiplex Ligation-dependend Probe Amplification Schouten a kol., 2002 (Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification. Nucleic Acids Res. Jun 15;30(12):57) MRC Holland, www.mlpa.com MLPA je: Citlivá: iba 20 ng DNA Špecifická: MLPA je schopná odlíšiť sekvencie líšiace sa v jedinom nukleotide Multiplexná: dokáže detekovať zmeny počtu kópií až 45 špecifických sekvencií v jednej reakcii Jednoduchá: MLPA reakciu je možné uskutočniť v jednej skúmavke Relatívne lacná metóda: Kit obsahuje všetky potrebné reagencie, nevyhnutné vybavenie je bežnou súčasťou všetkých molekulárne-biologických laboratórií MLPA má aj svoje nevýhody: vysoká citlivosť na kontamináciu reakcie časovo náročná a obtiažna výroba vlastných sond minimálne 50% buniek nesúcich danú prestavbu bodové mutácie alebo polymorfizmus v mieste ligácie môžu viesť k falošným výsledkom PCR primer Y Hybridizačná sekvencia PCR primer X vložená sekvencia (odlišná pre každú sondu) Hybridizačná sekvencia Syntetický oligonukleotid 50-60 bp M13-derivovaný oligonukleotid 60-450 bp A takto MLPA funguje… MRC Holland, www.mlpa.com MRC Holland, www.mlpa.com kapilárna elektroforéza A takto MLPA funguje… Pacient Kontrola A takto MLPA funguje… S hodnotením je to niekedy ťažšie 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 Chr.1p Chr.4p Chr.7p Chr.10p Chr.13p Chr.16p Chr.19p Chr.22p Chr.2q Chr.5q Chr.8q Chr.11q Chr.14q Chr.17q Chr.20q Chr.X/Yq MLPA Kity fy MRC Holland aneuploídie celých chromozómov 13, 18, 21, X a Y delécie a duplikácie chromozómových oblastí a celých génov (DiG, CMT1, subtelomerické oblasti) delécie a duplikácie v jednom alebo viacerých exónoch (DMD) metylácia DNA ⇒⇒⇒⇒ 120 rôznych aplikácií OLG FN Brno: subtelomerické prestavby u pacientov s MR DiGeorge syndróm delécia exónov u pacientov s DMD prestavby u pacientov s NF delécia RB1génu Cytogenetika: kultivace tkáně tumoru; vyšetření karyotypu Molekulární cytogenetika: I –FISH: amp.MYCN del 1p36 gain 17q CGH, HR-CGH array-CGH SKY, MLPA Molekulární genetika: tyrozinhydroxyláza, protein PGP 9.5 Využití metod molekulární cytogenetiky u solidních nádorů : Neuroblastom(mimo jiné..) OLG FN Brno NB I-FISH amplifikace MYCN genu OLG FN Brno Souhrn CHA u pacientů ze skupiny HR NB strukturní změny chromozomů: zisk 2p a 17q, delece 1p, 3p, 9p,11q Souhrn CHA u pacientů ze skupiny IMR NB Ztráty genetického materiálu označeny červeně a zisky zeleně numerické změny chromozomů: -3,-4,-8,-9,-14,-15,-16,-19,-X +2,+5,+6,+7,+17,+18 NB CGH : profily pacientů NB array CGH amplifikace MYCN genu Význam molekulárně cytogenetických vyšetření : I-FISH, CGH komplexní analýza cytogenetických změn individualizace léčebné terapie array-CGH upřesnění stratifikace pacientů Spektrum molekulárně cytogenetických vyšetření -Prenatální genetická diagnostika -Klinická ( postnatální) cytogenetika -Onkogenetika Spektrum molekulárně cytogenetických vyšetření Prenatální genetická diagnostika PV – kultivovaná, nekultivovaná, fetální krev, choriové klky • trizomie chromozómů 13, 18, 21 (Patau, Edwards, Down sy) • vyšetření sestavy a počtu gonozomů (XX, XY) • mikrodeleční syndromy (DiGeorge, del(22)(q11.2),...) • vyšetření suspektních CHA (balancované translokace,...) Downův syndrom FISH: + 21 OLG FN Brno Prenatální genetická diagnostika Downův syndrom OLG FN Brno Prenatální genetická diagnostika Edwardsův syndrom Pataův syndrom Prenatální genetická diagnostika Klinefelterův syndrom 47,XXY vysoká postava, porucha růstu vousů, ženská distribuce podkožního tuku,PMR OLG FN Brno Prenatální genetická diagnostika Turnerův syndrom 45,X chybí jeden chromozom X 1/2500 dívek 95 % SA malá postava, chybí vaječníky až sterilita OLG FN Brno výskyt v populaci s četností asi 1 : 500 neovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v populaci mentálně retardovaných pacientů) významná příčina sterilit u přenašečů v důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece) Prenatální genetická diagnostika Balancované translokace - důsledky www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/medgen/chromo/translocations.html Prenatální genetická diagnostika Ukázka karyotypu s translokací OLG FN Brno OLG FN Brno Klinická cytogenetika Preimplantační genetická diagnostika (PGD) •Nutné postupy asistované reprodukce – IVF - Vyšetření 1-2 buněk třídenního embrya in vitro pomocí FISH metody, - možnost detekce genetické abnormality budoucího plodu - vyřazení patologických embryí z programu IVF - transfer embrya bez genetické zátěže do dělohy matky cílem je zvýšit úspěšnost metod asistované reprodukce a snížit riziko SA, především pak narození zdravého potomka blastomera limitovaný počet buněk dostupných genetické analýze možné riziko narušení vývoje vyšetřovaného embrya není vyloučená jiná genetická vada doplnění PGD amniocentézou Klinická cytogenetika Preimplantační genetická diagnostika (PGD) OLG FN Brno 1. Spektrum molekulárně cytogenetických vyšetření -Prenatální genetická diagnostika -Klinická ( postnantální) cytogenetika -Onkogenetika Klinická cytogenetika lymfocyty periferní krve, bukální stěry • detekce mikrodelečních syndromů – FISH, MLPA • detekce mikrodelecí v subtelomerických oblastech – FISH, MLPA • analýza původu marker chromozómů – CGH, SKY • identifikace a upřesnění strukturních chromozomových přestaveb • detekce malých numerických mozaik - FISH 1. Spektrum molekulárních cytogenetických vyšetření FISH: delece 1p36SKY: identifikace marker chromozómu pocházejícího z chr. 11 OLG FN BrnoOLG FN Brno Klinická cytogenetika Mikrodeleční syndromy (nezachytitelné pomocí klasické cytogenetiky) del 22q11 (DiGeorge syndrom) SRDEČNÍ VADY: • přerušení oblouku aorty • Fallotova tetralogie: neúplné mezikomorové septum stenóza plicnice hypertofie levé komory posun aortálního oblouku nad pravou komoru ANOMÁLIE TVÁŘE: • nízko položené uši s abnormálním ohybem ušního boltce • úzká oční štěrbina • malá ústa a malá dolní čelist • bulbózní nos s čtvercovou špičkou • submukózní nebo viditelný rozštěp patra PORUCHY IMUNITY: • nedostatek T-lymfocytů , hypokalcémie Klinická cytogenetika Mikrodelece 22q11 DiGeorgeův/VCFS syndrom mikrodelece na chromozomu 22 v oblasti q11.2 patří mezi nejčastější konstituční aberace u člověka pacienti s mikrodelecí se vyskytují v populaci s četností 1: 4000 až 1: 6000 živě narozených dětí přibližně 90 % probandů má de novo deleci 22q11, asi u 6% se jedná o familiární přenos Nerovnoměrný crossing-over 22 22 del(22q11) dup(22q11) syndrom DiGeorge syndrom cat-eye normální normální http://camelot.lf2.cuni.cz/turnovem/ublg/vyuka/prf/Cytogenetika_cloveka_PrFUK_5b.ppt#300,4,Nerovnoměrný crossing-over OLG FN Brno Syndromy Prader-Willy a Angelman abnormality na chromozomu 15 v oblasti 15q11-q13 klinicky naprosto odlišné syndromy!! Klinická cytogenetika Mikrodeleční syndromy OLG FN Brno Klinická cytogenetika Prader-Willy syndrom Hlavní klinické příznaky: Snížená aktivita plodu Neprospívání kojenců Hypotonie novorozenců Obesita Hyperfagie, neukojitelný hlad Hypogenitalismus, hypogonadismus PMR Malá postava Akromikrie Hypopigmentace Problémy s chováním OLG FN Brno Klinická cytogenetika Angelman syndrom Hlavní klinické příznaky: Vážná PMR Trhavé pohyby, špatná rovnováha Hyperaktivita Výbuchy smíchu , šťastná povaha Absence řeči Hypotonie Epilepsie Abnormální tvar lebky Hypopigmentace OLG FN Brno Klinická cytogenetika Genetické příčiny vzniku PWS a AS Prader-Williho syndrom 1. Delece na paternálním chromozómu 15 (70%) 2. Maternální uniparentální disomie chromozómu 15 (20 - 25%) 3. Změna imprintingu (2 - 4%) 4. Různé chromozomální přestavby (méně než 5%) Angelmanův syndrom 1. Delece na maternálním chromozómu 15 (70%) 2. Paternální uniparentální disomie chromozómu 15 (4%) 3. Změna imprintingu (1%) 4. Různé chromozomální přestavby (2%) 5. Mutace v genu UBE 3A (3 - 5%) Klinická cytogenetika Identifikace markerových chromozomů „supernumerary marker chromosome“, markerový chromozom či jen marker; je to malý nadbytečný chromozom, který není možno analyzovat cytogenetickými pruhovacími metodami; výskyt - 1/4000 u novorozenců, 1/2500 u amniocentéz; OLG FN BrnoOLG FN Brno Klinická cytogenetika Základní charakteristika markerových chromozomů chromozom - nese funkční kinetochory, většinou se stabilně dědí; malý - velikost obvykle menší než chromozomy skupiny G; nadbytečný - výjimka jsou markery odvozené od gonozomů; nepřítomnost pruhového vzoru - nelze analyzovat běžnými cytogenetickými metodami; Klinická cytogenetika Delece subtelomerických oblastí OLG FN Brno 1. Spektrum molekulárně cytogenetických vyšetření -Prenatální genetická diagnostika -Klinická ( postnatální) cytogenetika -Onkogenetika 1. Spektrum molekulárně cytogenetických vyšetření Onkogenetika kultivované buňky KD, nátěry KD, otisky nádorů, DNA z KD a nádorů • detekce prognosticky významných specifických CHA u některých hematologických malignit (AL, CL, MDS, lymfomy), u dětských solidních nádorů (NB, meduloblastom, Ewingův sarkom) • FISH, CGH, SKY Komplexní karyotyp pomocí SKY Amplifikace N-myc onkogenu OLG FN Brno OLG FN Brno Onkogenetika Cytogenetická vyšetření v onkologii nedílná součást všech onkohematologických vyšetření cytogenetické a molekulárně genetické metody používané v onkohematologii jsou součástí diagnostiky a léčby těchto malignit ve smyslu: upřesnění diagnozy stanovení léčebné strategie monitorování léčby sledování reziduální choroby po transplantaci předpověď pravděpodobného vývoje onemocnění lokalizování protoonkogenů a tumorsupresorových genů Onkogenetika Chromozomové změny u nádorů – rozdělení I. • ztráta genetického materiálu (delece, monozomie) • zmnožení genetického materiálu (duplikace, amplifikace, trizomie, polyploidie) • přemístění bez ztráty materiálu (translokace, inverze, inzerce) Onkogenetika Chromozomové aberace u nádorů – rozdělení II. primární základní při vzniku nádorů, jediná změna, spouští mnohastupňový proces karcinogeneze sekundární objevují se v průběhu onemocnění, obraz stadia choroby, výraz progrese tumoru, prognostický faktor progrese onemocnění ------------------------------------------------------------------------------------------- specifické pravidelně u určitého typu nádoru, představují specifický nádorový marker, v místech zlomu byly identifikovány geny, které jsou zúčastněné v nádorovém procesu náhodné vyskytují se náhodně, postihují různé chromozomy -AMPLIFIKACE -DELECE -DUPLIKACE -INVERZE -INZERCE -TRANSLOKACE -INVERZE Onkogenetika Typy CHA Početní (numerické) Strukturní: OLG FN Brno http://creationwiki.org/Mutation Onkogenetika Početní CHA u nádorů aneuploidie x polyploidie hyperdiploidie (více než 46 chromozomů) – často lepší prognóza (ALL, mnohočetný myelom) hypodiploidie – méně než 46 chromozomů – horší prognóza (mnohočetný myelom) Onkogenetika Strukturní CHA: Amplifikace časté u solidních nádorů ale i u leukémíí většinou zmnožení proto- onkogenů double minutes (d-min) vyšetření pomocí FISH, počet signálů v buňce vyšetření přítomnosti amplifikace má klinický a terapeutický význam Amplifikace MYCN genu (2p24) OLG FN Brno OLG FN Brno Onkogenetika Strukturní CHA : Delece ztráta části chromozomu, často postiženy nádorovésupresorové geny nebo geny pro stimulační a růstové faktory LOH-ztráta heterozygotnosti v důsledku delece genu u hematologických malignit specifické změny neuroblastom melanom plicní karcinom Wilmsův testikulární tumor tumor Onkogenetika Ztráta části chromozomu je častou příčinou různých typů solidních nádorů - příklady delecí Onkogenetika Příklady delecí del 5q u AML a MDS, delece je intersticiální, rozsah velmi variabilní, vždy je postižen pruh 5q31-kritická oblast, v oblasti zmapováno více genů řídících normální hemopoézu, předpokládá se přítomnost nádorového- supresorového genu del 11q23 u AML a ALL, v oblasti 11q23 mapován MLL gen, mimo delecí zúčastněn v početných translokacích (6q27, 9p21, 10p15, 17q11, 19p13) monozomie ztráta celých chromozomů, změny jsou spíše sekundární, častá monozomie 5, 7 u MDS Onkogenetika Strukturní CHA : Duplikace celé chromozomy nebo jejích části časté sekundární změny v nádorových buňkách zmnožení genové dávky Stav a progrese nádorového onemocnění u leukémií časté +8, u CLL specifická +12, další Ph Onkogenetika Strukturní CHA : Inserce a Izochromozom AML-M4eo inv(16), t(16;16) fúzní gen CBF/MYH11 asi 50% má přídatné změny 7q-, +8, +21 spojená s dobrou prognózou detekce FISH pomocí specifické sondy Onkogenetika Strukturní CHA : Inverze Onkogenetika Translokace : Důsledky jednotlivých chromozómových aberací v procesu karcinogeneze v místech zlomů identifikovány geny přímo zúčastněné v nádorovém procesu dva principiální důsledky translokací a inverzí: místo zlomu uvnitř genů na každém chromozomu, přeskupením se vytvoří fúzní gen, kódující chimérický protein, zapojený do maligního procesu deregulace exprese genu (aktivace protoonkogenu) translokací do oblasti silného promotoru (gen pro T-cell receptor nebo imunoglubulínový protein) Onkogenetika Důsledky chromozómových aberací v procesu karcinogeneze; Translokace spojené se vznikem chimerického proteinu t(9;22) u CML, vzniká Ph chromozom na chromozomu 9q34 je lokalizován buněčný protoonkogen ABL, na chromozómu 22q11 BCR gen, při translokaci vzájemná výměna částí obou chromozomů na chromozomu 22 se vytvoří fúzní gen BCR/ABL, který kóduje hybridní protein p210, který je iniciátorem maligního procesu t(15;17) AML M3, fúzní protein PML/RARA je pravděpodobně cílovým proteinem při terapii trans retinovou kyselinou, přímý vztah léčby genetického defektu a maligního onemocnění OLG FN Brno Philadelphský chromozóm translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2) www.abbott molecular t(8;14) u ALL a lymfomů c-MYC onkogen z 8q24 přesunut do oblasti genu pro těžký řetězec imunoglobulinu na 14q32 přemístěním dochází k deregulaci exprese c-MYC protookogenu deregulace spouští proces karcinogeneze t(2;8), t(8;22) variantní translokace s místem zlomu v c-MYC genu Onkogenetika Důsledky chromozómových aberací v procesu karcinogeneze; Translokace spojené s aktivací protoonkogenů Onkogenetika Komplexní aberace Komplexní karyotyp – detegujeme numerické či početní změny zahrnující tři a více chromozomů nebo strukturní změny, při kterých dochází ke třem a více zlomům Doporučená literatura Snustad, Peter, D.: Genetika, Masarykova Univerzita, 2009 Kuglík, Petr : Základy molekulární cytogenetiky člověka; elektronická skripta, http://www.sci.muni.cz/UEB/OGMB/Cytogenlab.html Thompson & Thompson : Klinická genetika, Praha : Triton, 2004 Děkuji za pozornost