Přehled mikrobiologických vyšetřovacích metod Mikrobiologie a imunologie – BOMI0111s Týden 2 Ondřej Zahradníček Obdélníky a kulaté obdélníky O co se snaží laboratoř klinické mikrobiologie l1. Odhalit původce nemoci (patogena – ne tedy jakéhokoli mikroba náhodou přítomného v těle) l2. Někdy také: zjistit citlivost patogena na antimikrobiální látky (dělá se u bakterií a kvasinek, nedělá se u parazitů a vláknitých hub, u virů je to zatím ve fázi výzkumu) l3. Někdy také: určení faktorů virulence (např. u střevní anaerobní bakterie Clostridium difficile je nález bakteriálního toxinu (jedu) důležitější než samotný nález bakterie, která se v malých množstvím vyskytuje i ve střevě zdravých lidí a nemusí nutně škodit) Co je to (klinický) vzorek lVzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře (obecně je samozřejmě vzorkem i kus horniny, potraviny apod., ale v klinické mikrobiologii nám jde o klinické vzorky). Nejčastěji se posílá lkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) lstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média lobčas i něco jiného (otisk tkáně, nátěr na sklíčko) lTypický je případ, kdy jako vzorek použito něco, co by mohlo/mělo obsahovat hledané patogeny (u močové infekce moč, u angíny výtěr z krku a podobně). Toto neplatí u tzv. nepřímého průkazu, o kterém bude řeč dále Co je to kmen lNěkdy je nejprve nutno ze vzorku (který obsahuje i pacientovy buňky a mikrobů tam může být víc najednou) izolovat čistou kulturu jediného mikroba (většinou bakterie nebo kvasinky) – takové čisté kultuře říkáme kmen lKmen je čistá kultura („výpěstek“) mikrobů, vzniklá (teoreticky) z jedné buňky. Všechny buňky patřící ke stejnému kmeni mají stejné vlastnosti (kdežto v rámci jednoho druhu můžeme mít různé kmeny, trochu se vlastnostmi lišící) lKmen nám nahrazuje jedince tam, kde s jedincem nemůžeme pracovat (např. metabolismus jedné buňky není reálně možné testovat) lKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. lKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. V praxi (vyšetření sputa) lVzorek sputa à práce se vzorkem (kultivace, mikroskopie, popř. další) l –Kmen zlatého stafylokoka à práce s kmenem (bližší určení různými metodami, testování citlivosti na antibiotika) –Další kmeny à podle vzhledu patří k běžné mikroflóře, a tak s nimi už dále nepracujeme Přehled metod lMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt –Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem –Identifikace kmene – určení kmene (izolátu) vypěstovaného na pevné půdě lMetody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů 1. Mikroskopie Co vidíme v mikroskopu lV případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk lV případě mikroskopování vzorku můžeme vidět –mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů –buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty –jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Typy mikroskopie lElektronová mikroskopie – u virů; spíše výzkum než při běžném průkazu virů lOptická mikroskopie –Nativní preparát – na velké a/nebo pohyblivé mikroby –Nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety), fázový kontrast a další fyzikální varianty –Fixované a barvené preparáty, například: lBarvení dle Grama – nejdůležitější bakteriologické lBarvení dle Ziehl-Neelsena – např. u bacilů TBC lBarvení dle Giemsy – na některé prvoky lFluorescenční barvení U barvených preparátů se obvykle používá tzv. imersní systém (mezi objektiv a sklíčko se kápne imersní olej) Gramovo barvení – princip Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se fialově Obarví se fialově Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se červeně Gramem se nebarvící bakterie se neobarví v prvním kroku kvůli absenci buněčné stěny (Mycoplasma) nebo proto, že jejich stěna je vysoce hydrofobní (Mycobacterium). Spirochety by se barvily gramnegativně, ale jsou velmi tenké, takže i je lze také vlastně považovat za „Gramem se nebarvící“ a Gram se v jejich diagnostice nepoužívá. Dift1 P1010003 Mikroskopie vzorku Mikroskopie kmene Foto: archiv MÚ 2. Kultivace Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) lBakterie často pěstujeme na umělých půdách lBakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) lZa 24 (někdy až 48) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly lVláknité houby se pěstují mnohem déle lViry a paraziti se většinou vůbec nepěstují Kultivace bakterií – podmínky lBakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod. lNěkteré (teplota) jsou dány nastavením termostatu, jiné (procento solí) složením kultivační půdy lPoužíváme různá kultivační média, sloužící k určitým účelům lAerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry lStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku. Kapnofilní zase zvýšený podíl CO2. lPřipravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce P1010008 Foto: archiv MÚ Smysl kultivace bakterií lProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? –Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) –Abychom získali kmen – pouze pevné půdy –Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k.identifikaci Kultivace v praxi lVzorek se vloží do tekuté půdy nebo nanese na pevnou půdu lU pevné půdy se ho snažíme tzv. mikrobiologickou kličkou rozředit, abychom získali jednotlivé kolonie a mohli dále pracovat s.kmeny mikrobů lTekuté půdy –jsou půdy pomnožovací –základem je zpravidla hovězí vývar a bílkovinný hydrolyzát –nejdůležitější je peptonová voda, bujón, VL-bujón, selenitový bujón (selektivně pomnožovací) Tekuté půdy P1010001 Foto: archiv MÚ Hemofil na ČA Pevné (agarové) půdy lAbychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. •Základem je opět masopeptonový bujón, ale navíc obsahují výtažek z agarové řasy. Používala se i želatina, ale neosvědčila se tolik jako agar. Foto: www.medmicro.info V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Rozočkování 1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až na konci izolované kolonie Pojem kolonie lKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) lKolonie je tedy vždy tvořena jedním kmenem. lV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) lPopis kolonií má významné místo v.diagnostice S3 Foto: archiv MÚ Co se dá popisovat u kolonií lVelikost lBarva lTvar (okrouhlý…) lProfil (vypouklý…) lOkraje (výběžky..) lPovrch (hladký, drsný) lKonzistence (suchá…) lPrůhlednost lVůně/zápach lOkolí kolonie To vše ale pouze v případě, že se podařilo rozočkováním získat jednotlivé kolonie. Tam, kde je hustý nárůst, se většina těchto vlastnosti hodnotit nedá. Kult5 Pevné půdy Foto: archiv MÚ Existují různé typy pevných půd lDiagnostické půdy – roste "kdeco, ale různě" (krevní agar, VL krevní agar) –Chromogenní půdy – zvláštní druh diagnostických půd lSelektivní půdy – roste "jen málo co" (krevní agar s 10 % NaCl pro kultivaci stafylokoků) lSelektivně diagnostické půdy – např. Endova (rostou tam jen některé G– bakterie = selektivita + rozlišení bakterií podle štěpení laktózy = diagnosticita) lObohacené půdy – k pěstování náročných baktérií (čokoládový agar, což je zahřátý krevní agar) lSpeciální půdy – mají své zvláštní určení (MH půda pro testy citlivosti kmene k antibiotikům) Kult6 Půdy diagnostické lNepotlačují růst žádného mikroba lZato díky svému složení rozlišují mikroby podle určité vlastnosti lPříkladem je krevní agar ke sledování hemolytických vlastností a VL krevní agar (podobný, ale na anaeroby) lZvláštním případem půdy chromogenní a fluorogenní Hemolýzy Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Pevné selektivní půdy lÚčelem je selektovat (vydělit) ze směsi baktérií pouze určitou skupinu nebo skupiny lPříkladem je agar pro stafylokoky s 10 % NaCl. (Oproti 0,9 % u běžného agaru. Je logické, že na této půdě rostou právě stafylokoky. Jsou to totiž kožní bakterie, zvyklé na život v kůži, občas i zpocené a slané.) lNěkdy je selektivnosti dosaženo přidáním antibiotika. Krevní agar s amikacinem je selektivní pro streptokoky a enterokoky Příklad selektivně diagnostické půdy – Endova půda lEndova půda umí také rozlišit bakterie podle toho, jestli dovedou štěpit laktózu, nebo ne (diagnostická vlastnost). Kult9 Endova půda je selektivní jen pro některé gramnegativní tyčinky (selektivní vlastnost) Foto: archiv MÚ Půdy se používají i k testování citlivosti na antibiotika atbstau17 atbpsae21 lV tomto případě se bakterie naočkují po celé ploše a na půdu se nakladou kulaté papírky napuštěné jednotlivými antibiotiky (antibiotické disky). Antibiotika difundují agarem. Je-li kmen citlivý, vytvoří se zóna citlivosti. lNejčastěji se používá bezbarvá MH půda, na které je zároveň dobře vidět i pigmenty bakterií Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Postup očkování výtěru z krku Očkování výtěrů 1 očkováno tamponem 2 očkováno kličkou 3 stafylokoková čára 4 disk BH (bacitracin pro hemofily) 5 disk VK (vankomycin a kolistin pro meningokoky) Na celé naočkované ploše pátráme po streptokocích (bezbarvé) a po stafylokocích (spíše bílé či zlatavé) Výtěr z krku – reálný výsledek vytkrk Foto: archiv MÚ Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae3 Anaerobní bakterie nesnášejí kyslík. Musíme je tedy pěstovat ve speciální atmosféře bez kyslíku. Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ 3. Biochemická (a jiná) identifikace kmenů Biochemické identifikační metody lObecný princip je téměř vždy stejný: Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt(y). Produkt(y) se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor lExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. lI mezi savci jsou rozdíly: člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano. Nedivme se tedy, že existuje tolik rozdílů mezi bakteriemi. Možnosti praktického provedení lRychlé testy (vteřiny až minuty) –Katalázový test –Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) lTesty s inkubací (hodiny až dny) –Jednoduché zkumavkové testy –Složité zkumavkové testy –Sady jednoduchých zkumavkových testů –Testy v plastové destičce (miniaturizace) –Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test lKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 14 catalase medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm 08 oxidase3 Příklady dalších testů: oxidázový test (diagnostický proužek) medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Provedení testu v praxi Obrázek20 Foto: archiv MÚ 11 indole …a další testy 15 urease2 medic.med.uth.tmc.edu Moderní biochemické testy zahrnují i desítky reakcí lTesty se dělají v důlcích plastových mikrotitračních destiček. lPočet testů v sadách kolísá od sedmi až po více než padesát lLiší se v technických detailech. Vždy je však substrát vysušený (případně lyofilizovaný), bakterie se nejprve rozmíchá ve fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr Foto: O. Z. Zahraniční soupravy 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 Foto: O. Z. http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. 02 API systémy www.ucd.ie/kyr/Images/jpgs/Photo16.htm Další identifikační metody lNe všechny identifikační metody jsou založeny na principu substrát à produkt. lK identifikaci kmene lze využít například typickou citlivost na antibiotika, ovlivnění růstu jedné bakterie druhou, růst při určitých teplotách, testování pohybu a podobně. lV poslední době se prosazují nové metody, například hmotová spektrometrie typu MALDI-TOF, kde se hodnotí ionty vzniklé z proteinů typických pro jednotlivé druhy bakterií či kvasinek. lIdentifikace antigenní analýzou kmene bude probrána dále. Většinou se používá k vnitrodruhové identifikaci (např. odlišení tzv. EPEC od běžných E. coli) 4. Pokus na zvířeti Pokus na zvířeti lPokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Jsou už jen výjimečné případy, kdy se uplatní i dnes. newzealand7 www.rockinjawrabbits.com/newzealand.htm 5. Průkaz nukleové kyseliny Průkaz nukleové kyseliny lmetody bez amplifikace nukleové kyseliny (klasické genové sondy) lmetody s amplifikací (namnožením) –PCR (polymerázová řetězová reakce) –LCR (ligázová řetězová reakce) lPrincipiálně se použití v mikrobiologii neliší od použití jinde (např. v genetice) lNevýhoda – někdy jsou až příliš citlivé, takže se prokáže každá molekula DNA, která mohla třeba „přilétnout odněkud zvenčí“. Citlivost se dnes ale dá omezit. 6. Průkaz antigenu + průkaz protilátky Metody založené na interakci antigen – protilátka lO antigenech a protilátkách bude ještě řeč, až se budou probírat základy imunologie. lProzatím si pouze představíme v hrubých rysech mikrobiální antigen a protilátku proti němu, abychom si pak ukázali, jak se jejich vzájemná interakce využívá v diagnostice Co je to protilátka (Ig = imunoglobulin) lProtilátka je bílkovina, imunoglobulin, produkt imunitního systému člověka (nebo zvířete). lProtilátka se dá prokázat pomocí specifického antigenu, proti kterému se vytvořila Co je to antigen (Ag) Antigen je struktura na povrchu mikroba (ale i třeba pylového zrnka či zvířecího chlupu), které tělo provokuje k tvorbě protilátek Antigen se dá prokázat pomocí protilátky, která se proti němu vytvořila například u zvířete Serologické metody (založené na interakci antigen – protilátka) lpracují s reakcí antigen – protilátka (za vzniku komplexu); vzájemně se liší způsobem detekce komplexu antigen – protilátka lpři stejném principu metod se dají využít pro průkaz antigenu (pomocí zvířecí protilátky) i pro průkaz protilátky v těle pacienta (pomocí antigenu mikroba, nebo i celého mikroorganismu) Jak si to představit lNeznámý klíč mohu zkoušet strkat do různých zámků, abych zjistil, ke kterému z nich se hodí: testuji klíč pomocí různých zámků lNeznámý zámek mohu zkoumat tak, že do něj zkouším strkat různé klíče, abych zjistil, který klíč se k němu hodí: testuji zámek pomocí různých klíčů lPřitom není pochyb, že zámek je něco úplně jiného než klíč! Serologická reakce v praxi TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - www.medmicro.info Protilátku antigenem, nebo antigen protilátkou? Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Přímý a nepřímý průkaz: Různé vzorky lPrůkaz antigenu ve vzorku je přímou metodou, stejně jako třeba kultivace či mikroskopie. Jako vzorek tedy použijeme to, v čem předpokládáme nález mikroba: u meningitidy mozkomíšní mok, u střevních nákaz stolici apod. Nebo použijeme kmen, který jsme z takového vzorku izolovali (pak jde o antigenní analýzu kmene) lPrůkaz protilátek je metodou nepřímou. Až na naprosté výjimky hledáme protilátky v jednom jediném typu vzorku: v séru Průkaz antigenu a antigenní analýza lV rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze tedy dále rozlišit dva podtypy: –Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku –Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) lU nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, jak již bylo uvedeno Serologická laboratoř Obrázek10 Foto: archiv MÚ Čerstvá, nebo dávno prodělaná nákaza? lPo nákaze přetrvávají protilátky dlouhodobě, někdy celoživotně. Samotný nález protilátek tedy tolik neznamená. Pro rozlišení čerstvé × dávno prodělané nákazy se používá: –zjištění množství protilátek (jako tzv. titru) a změna tohoto množství v čase (dynamika titru; za významnou se považuje čtyřnásobná změna, anebo tzv. serokonverze = v prvním vzorku ještě protilátky nejsou, ve druhém ano) –rozlišení protilátek třídy IgM a IgG (jen u některých novějších reakcí je to ovšem možné) –stanovení tzv. avidity (síly vazby protilátek) Průběh protilátkové odpovědi lAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM lPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) lChronická infekce: různé možnosti IgM a IgG 1 1 2 2 Ukázka serologické reakce ELISA ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! Foto: archiv MÚ Přehled sérologických metod lPrecipitace (nejstarší a nejjednodušší) lAglutinace (a aglutinace na nosičích) lKomplementfixační reakce (KFR) lNeutralizace (ASLO, HIT, VNT) lReakce se značenými složkami: –Imunofluorescence (IMF) –Radioimunoanalýza (RIA) –Enzymová imunoanalýza (EIA, ELISA) –Imunobloty (= zvláštní případ ELISy) Principy jednotlivých metod lAglutinace a precipitace: komplex Ag – Ig je viditelný. U precipitace se použije samotný Ag, u aglutinace je Ag navázán na částici lKomplementfixace: složitá reakce s využitím jedné složky imunitního systému – komplementu (užívá se morčecí komplement) lNeutralizace: využití přirozené schopnosti protilátek neutralizovat účinek viru či toxinu lReakce se značenými složkami: postupné navazování na povrch, co se neodplaví, zůstane a je detekováno Rozdíl mezi staršími a novějšími metodami lStarší metody (aglutinace, komplementfixace, neutralizace) neumějí rozlišit protilátky třídy IgG a IgM. Proto je tu nutno odebírat dva vzorky séra a sledovat dynamiku titru. Důležité je na žádanku uvést datum prvních příznaků a údaj, zda jde o I. či II. vzorek séra! lNovější metody toto nepotřebují. Titry se nezjišťují, u metody ELISA se zato zjišťují hodnoty absorbance, odpovídající intenzitě reakce (množství molekul, které reagovaly) Příklady interpretace serologických reakcí – 1 lTěhotná pacientka má IgG protilátky proti toxoplasmóze, IgM je negativní lZnamená to, že toxoplasmózu prodělala (možná i bezpříznakově) a teď už není nemocná, ale je chráněná. Je na tom tedy lépe, než kdyby protilátky neměla lPacient má protilátky proti klíšťové encefalitidě v prvním vzorku 1 : 10, ve druhém 1 : 160 lPravděpodobně jeho potíže opravdu způsobil daný virus. Vzestup titru je 16×, to je významné (> 4×) Příklady interpretace serologických reakcí – 2 lIvana má protilátky proti chřipce, v prvním vzorku 1 : 10, ve druhém 1 : 20 lNejspíš je to jen náhoda, Ivana asi chřipku kdysi prodělala, ale nepůjde o akutní stav. Možné je odebrat ještě třetí vzorek lPacient nemá vůbec žádné protilátky proti borelióze, ačkoli potíže odpovídají této nemoci lPacient asi má boreliózu, ale ještě se nestihly vytvořit protilátky. Pokud jsou příznaky typické, je třeba ho léčit, a vzorek séra odebrat znovu. Závěr: Práce laboratoře v praxi Práce laboratoře v praxi lDo laboratoře přijde vzorek lK nepřímému průkazu jsou přijímány vzorky séra (kde hledáme protilátky) lK přímému průkazu jsou přijímány vzorky z těch míst na těle, kde předpokládáme infekci: nejčastější jsou výtěry z krku a nosu, vzorky moče a stolice, ale někdy přijde i třeba kousek srdeční chlopně odebraný při operaci Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!! KLINICKÉ PRACOVIŠTĚ LABORATOŘ Indikace vyšetření – zda, jaké Vlastní provedení odběru Transport materiálu Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu Zaslání výsledku Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Nashledanou příště… Foto: O. Z. P519_03sput_gnty_u2