Optické metody Katedra laboratorních metod LF MU Mgr. Jana Gottwaldová Optické analytické metody •Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. •využívá interakce analytu se světlem - optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy •může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem Spektrofotometrie x fotometrie lPatří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii lStanovení vlastností vzorku, např. koncentrace určité látky, na základe pohlcování světla určité vlnové délky se označuje jako fotometrie. lPokud se neměří jen při jedné vlnové délce, ale hodnotí se určitý úsek spektra, mluvíme o spektrofotometrii. l l l Spektrofotometrie-rozdělení lPodle frekvence elektromagnetického záření: lUV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190-400 nm lVIS spektr. – oblast viditelného záření λ=400-800 nm lIČ spektr. – oblast IČ spekter se dělí na blízkou IČ λ=800-2000 nm, dalekou IČ λ=105 nm l l l l l Spektrofotometrie-rozdělení lPodle typu interakce lelektromagnetického záření: l absorpční spektrofotometrii l emisní spektrofotometrii lTurbidimetrii, nefelometrii lLuminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence l l Optické metody l l ljsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením lSvětlo je druhem elektromagnetického záření lVlastnosti elektromagnetického záření - má duální charakter l l l lSložku magnetickou a elektrickou lVzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka- λ, udává se v nm Export1 Elektromagnetické záření Popisující veličiny elektromagnetického záření Ø •rychlost – c (m/s), ve vakuu 3x108 m/s • •vlnová délka - l (nm) l l •Frekvence světelných vln (=počet vln za sekundu) - n(Hz,s-1) • Ø Export1 Popisující veličiny elektromagnetického záření •energie fotonu světelného záření ε •Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6,625x10-34 J/s) l •Energie fotonu je nepřímo úměrná vlnové délce tzn. že světelné záření o kratší vlnové délce má vyšší energii, než světlo s delší vlnovou délkou l • Elektromagnetické záření lSvětlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 -1015 Hz l lMonochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky lPolychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky) Barevnost látek lPokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná lMá vždy barvu doplňkovou k barvě absorbovaného světla l Barevnost látek Barevnost látek Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l l l lPropustnost (transmitance): lMnožství světla určité vlnové délky, které prošlo lvzorkem lKde I0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I lje intenzita světla ze vzorku vystupujícího l Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii lAbsorbance: l l lBezrozměrná veličina, definovaná na základě lTransmitance, udává jaké množství světla bylo lpohlceno vzorkem. l Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii lZákon Lambertův-Beerův: l lI = I0 . 10-ε l c l lIntenzita světelného záření procházející labsorbujícím prostředím klesá exponenciálně v lzávislosti na délce absorbující vrstvy a lkoncentraci absorbující látky l l(Johan Heinrich Lambert, 1728-1777) Zákon Lambertův-Beerův Ø Ø Øabsorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Økoncentraci absorbujících částic ve vrstvě c ØKonstanta úměrnosti pro danou látku a danou vlnovou délku absorbovaného záření je molární absorpční koeficient ελ l Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii lmolární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky lTakto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti lPokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více lVztah mezi signálem ( absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací Kalibrační závislost lPraktické využití Lambertova-Beerova zákona lProvedení: lzměříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce lvšechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr,kyveta,pipety,doba inkubace..) lblank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky l l l Kalibrační závislost lSestrojení kalibrační křivky lnaměřené hodnoty absorbance standardů na ose y lhodnoty koncentrace na ose x l lPokud je závislost lineární, je lmožné změřit absorbanci a lvypočítat koncentraci lneznámého vzorku : l Avz lCvz= x cst l Ast Kalibrační závislost lVzhledem k tomu, že poměr lcst/Ast je pro měřenou sérii lkonstantní používáme ho pro lzměřenou sérii jako kalibrační lfaktor, kterým vynásobíme lnaměřené hodnoty absorbance lvzorků o neznáme koncentraci l lLOD-dolní mez detekce lLOL- horní mez detekce lLOQ-mez stanovitelnosti Limitace Lambertova-Beerova zákona lOdchylka ελpři vysokých koncentracích (>0,01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí lČástečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku lFluorescence nebo fosforescence vzorku lNedokonale monochromatické záření lNekoherentní světelné záření l Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu l absorbancí 0,2-0,7 . Od hodnot absorbance > l výrazně narůstá chyba měření Spektrofotometrie-rozdělení lPodle typu interakce lelektromagnetického záření: l absorpční spektrofotometrii l emisní spektrofotometrii lTurbidimetrii, nefelometrii lLuminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence l l l l Absorpční spektrofotometrie lzabývá kvantitativním hodnocením změny intenzity záření (obvykle určité vlnové délky) po průchodu analytickým prostředím. Při průchodu ektromagnetického záření z oblasti UV nebo VIS části spektra měřeným roztokem dochází k absorpci záření. lPřístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra se nazývají fotometry nebo spektrofotometry. Emisní spektrofotometrie lPři této technice se měří emise záření. K emisi záření charakteristické vlnové délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) do základního stavu. l lPřístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření, se nazývají emisní spektrofotometry Absorpce vs. emise záření lEmise záření: Dodáním energie (např. kinetické, tepelné) jsou částice látka (složky studovaného vzorku) převedeny do vyššího energetického stavu Při zpětném přechodu se energie vyzáří ve formě fotonu lAbsorpce záření: Částice látky absorbuje foton a přejde přitom do vyššího energetického stavu. (Návrat zpět do energeticky nižšího stavu již není sledován.) Turbidimetrie •Optická metoda založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích •V klinické biochemii je celá řada metod založených na měření stupně zákalu - turbidity - a nejvýznamnější z nich je soubor imunochemických metod, které využívají precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou • záření po průchodu nehomogenním prostředím, tj. koloidním roztokem nebo roztokem zakaleným jemnou sraženinou se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry turbi2 Nefelometrie • •zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření. •Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se difúzně rozptýlené světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry nefelo1 Luminisceční metody: fluorimetrie lPři fluorimetrických stanoveních se využívá jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla (excitační záření) vzniká fotoluminiscence. lPřístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření se nazývají fluorimetry Luminisceční metody -chemiluminiscence l lLiší se od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí. Přitom se však uvolněná energie nesmí uvolnit jako teplo. Některé látky dokáží část energie vyzářit ve formě fotonu přímo, což se projeví krátkým světelným zábleskem, v ostatních případech je nutné přidat do soustavy další látku, na kterou se energie přenese a která pak (zpravidla řadu sekund až minut) emituje světlo. l lMuže jít o syntetické luminofory nebo o přírodní enzym luciferázu světlušek – pak se mluví o bioluminiscenci. l lLuminimetrické metody bývají poměrně citlivé. Luminimetry jsou principiálně podobné emisní spektrofotometrii Spektrofotometry l lPřístroje, které se používají k měření intenzity l záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) l oblasti spektra l lSlouží pro měření absorpce světla vzorkem l lAbsorbance je měřena při různých vlnových délkách l Uspořádání spektrofotometru •Zdroj světla •Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky •Monochromátor nebo filtr: k výběru určité vlnové délky •Absorpční prostředí: kyveta s měřeným vzorkem •Detekční systém: zařízení k měření světelného záření, které prošlo vzorkem • Zdroje záření a jejich použití l lWolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru lDeuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru lXenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru lRtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200-400 nm l l l Wolframová žárovka – VIS oblast spektra lSkleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu lUvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem Deuteriová výbojka – UV oblast spektra lNízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160-360 nm Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra lVysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, potřebuje intenzivní chlazení l Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast lNízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové spektrum (200-400 nm) lPro klinickou biochemii je významná spektrální čára o vlnové 334 nm – pro měření redukované formy NADP (absorpční maximum 340 nm) Spektrofotometr - fotometrické filtry lSlouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. l lCharakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka lfiltru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v lpolovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky lpropustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr llepší. lFotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: lbarevné absorpční a interferenční l Spektrofotometr - fotometrické filtry lSpektrální pološířka lfiltru (h, nm) - odpovídá lintervalu vlnových délek záření lv polovině maximální lpropustnosti filtru – ltransmitance,je odvozena z lkřivky propustnosti). lČím je rozsah pološířky filtru lužší, tím je filtr lepší. l Křivka propustnosti Fotometrické filtry l lBarevné absorpční filtry - mají nižší spektrální lčistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30-80 lnm l lPevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem l lKapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí l Fotometrické filtry-interferenční filtry interferfiltr lInterferenční filtry využívají mnohonásobnou linterferenci záření mezi hraničními plochami ls výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku lpásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) lnež barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je lkovový Fabry-Perotův filtr. a, c – polopropustné vrstvičky b – vrstva dielektrika o tloušťce l/2 d, e – krycí vrstvy Fotometrické filtry-interferenční filtry lNa základní desce je mezi dvěma stříbrnými lpolopropustnými vrstvičkami vrstva průhledného ldielektrika o tloušťce l/2, přičemž l odpovídá lpožadované vlnové délce. lMnohonásobnými odrazy od zrcadlových ploch lfiltru a po vícenásobné interferenci dopadajících lpaprsků různé vlnové délky, vznikají velmi úzká lmaxima s pološířkou 8 – 10 nm. l interferfiltr Spektrofotometr - monochromátory lOptická zařízení pomocí kterých se ze spektra lpolychromatického světla mechanicky vymezí lpouze jeho určitá část. lSlouží pro kontinuální výběr různých vlnových ldélek l l l spec_fig1%20scanning Monochromátor l l lMonochromátor se skládá: lvstupní štěrbiny lpomocné optiky (zrcadla, čočky) ldisperzního prvku - mřížka,hranol lvýstupní štěrbiny l spec_fig1%20scanning Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina lVstupní – vymezuje malou část světelného toku lze zdroje záření lVýstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité lvlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma l(bandpass) a větší monochromatičnost záření. l lPoloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová ldélka se nastavuje přímým otáčením disperzního lprvku. l Monochromátor - pomocná optika lZrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou lpotažena obvykle vrstvou hliníku •Rovinná – nejvíce používaná •Dutá, kulová , parabolická • l Čočky – optický zaostřovací systém l l Optická vlákna – skleněná, křemenná lusměrňují transport světla ve stísněných prostorách l(vertikální fotometry k měření mikrotitračních ldestiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla l lClony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel l Disperzní prvek - optický hranol lrozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla lsvětelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou lSkleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400-800 nm) lKřemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm) l Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka lpracuje na principu odrazu světla lJe tvořena soustavou jemných rovnoběžných l vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) lNa vybroušených ploškách dochází mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření lRozklad záření je lineární u všech vlnových délek lMá lepší rozlišovací schopnost než hranol Výběr požadované vlnové délky lPřesným pohybem ldisperzního prvku lmonochromátoru je vzniklé lsvětelné spektrum lnasměrováno na výstupní lštěrbinu tak, aby jím lprošlo záření požadované lvlnové délky ☼ optické zrcadlo zdroj světla difrakční reflexní mřížka mikrometrický šroub kyveta detektor Spektrofotometr - Absorpční prostředí lKyveta s měřeným vzorkem lRozdělení: ldle velikosti: Makro- (1-2 ml), semimikro- l(<0,5 ml), mikro-(<100 μl) ldle typu: nalévací, průtokové ldle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) l automatických bioch. analyzátorech: •kyvety na jedno použití •trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí Absorpční prostředí spektrofotometru l Instr_tech_spektrofotom 008a Instr_tech_spektrofotom 006 zatavené kyvety z plastické fólie postup miniaturizace kyvet 400 µl 150 µl 80 µl Spektrofotometr - detekční systém lJe složen z detektoru záření a elektronického lzařízení pro zpracování jeho odezvy l lDetektory lZařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření lna jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou l lHradlový selenový fotočlánek lFotodioda lFotonásobič lDetektor diodového pole Detektor – hradlový selenový fotočlánek lSkládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě lSvětelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra lTím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření Detektor – fotodioda (fotonka) lPracuje na principu fotoelektrického efektu l lSkládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a lrůzné alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné lve vakuu l lFotokatoda uvolňuje při ozáření světlem lelektrony, které jsou přitahovány anodou čímž lvzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě lsvětelného záření l Detektor - fotonásobič •Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí •Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě •Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí •Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu • • • Detektor - fotonásobič l Detektor s diodovým polem lJe tvořen velkých množstvím miniaturních lfotodiod na malé ploše destičky na které dopadá lsvětelné záření po průchodu absorpčním lprostředím a následně rozložené lmonochromátorem na jednotlivé vlnové délky Detektor s diodovým polem spec_fig2%20diode%20array spec_fig1%20scanning • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem • Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory • Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance Bichromatické měření absorbance •měření vzorku při dvou vlnových délkách součastně •použití vlnové délky (λ2) mimo absorpční maximum (λ1) •Používá se za situace, kdy se v reakční směsi vyskytuje látka, která rovněž absorbuje záření použité vlnové délky (interferující látka) •Omezí se falešně zvýšený výsledek měření Konstrukce spektrofotomeru lJednopaprskové lUmožňují měřit absorbanci pouze v jednom labsorpčním prostředí (tj. v kyvetě s měřeným vzorkem lnebo v kyvetě s blankem) lZdroj světla lVstupní štěrbina lMonochromátor lVýstupní štěrbina lKyveta ldetektor Spektrofotometr Konstrukce spektrofotomeru lDvoupaprskový lDvě základní konstrukční řešení: lPaprsek určité vlnové délky z monochromátoru lje rozdělen na dvě části, jedna polovina prochází lkyvetou se vzorkem, druhá s kyvetou s blankem – lvyžaduje 2 detektory lPaprsek vycházející z monochromátoru je lrotujícím zrcadlem střídavě usměrňován na kyvetu lse vzorkem a směrován na jeden společný lfotonásobič l < ☼ M Vzorek Blank ☼ M Blank Vzorek Kontrola kvality spektrofotometru lPřesnost nastavené vlnové délky lOvěřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji lodpovídá skutečné vlnové délce procházejí lměřeným vzorkem. lPoužití rtuťové výbojky (ostré čárové spektrum) lPoužití absorpčních filtrů (z kysličníku holmia) s lpřesně definovaným absorpčním pruhem – filtr je lpřístrojem naskenován a zjištěný absorpční pík je lsrovnán se známým píkem. Povolená tolerance je l± 1-2 nm. Kontrola kvality spektrofotometru lPřesnost spektrofotometru - schopnost změřit labsorbanci přesně. l lK ověření se používají speciální absorpční filtry nebo roztoky o známé koncentraci lAbsorbance se proměřují v celém rozsahu spektra 302, 395, 512, 378 nm) Kontrola kvality spektrofotometru lLinearita spektrofotometru – schopnost vykazovat llineární odezvu l lměření postupně ředěného roztoku o známé l koncentraci lVýsledkem je přímkový graf závislosti A (osa y) na c (osa x) lMěření se provádí při λ - 257, 41, a 630 nm l l Kontrola kvality spektrofotometru lRozptýlené světlo lSvětlo, které může dopadnout na detektor aniž lby prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé lodstínění optického systému spektrofotometru) lOvěřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru l lDrift signálu lSchopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu lSledování nulové linie l Děkuji za pozornost