NA STOPĚ PACHATELE Díl pátý: Gramnegativní zločinci II Mikrobiologický ústav uvádí L Přehled lékařsky významných G - tyčinek Příběh Endo Skupina P04 roste Enterobacteriaceae (GLC +, OXI -) P04 roste Vibrionaceae (GLC +, OXI +) P04 ne Campylobacter a Helicobacter 3. + 4. roste G- nefermentující bakterie (GLC -) 1. + 2. ne Pasteurellaceae P06 ne Další G- tyčinky, viz příští praktikum 14 HEIN Hemofil http://medinfo.ufl.edu Na začátek motto… nBylo nevlídno, že by PSAE ven nevyhnal… n(PSAE – zkratka pro Pseudomonas aeruginosa) 06 P textbookofbacteriology.net [USEMAP] Přehled témat Klinická charakteristika – Pasteurellaceae Klinická charakteristika – Gram– nefermentující bakterie Diagnostika hemofilů a pasteurel Diagnostika gramnegativních nefermentujících bakterií Klinická charakteristika – Pasteurellaceae 15 bild1001927121_Baby_Intensivstation_Nahaufnahme23b8e03a0130ce Příběh první nČtyřletý Kubík je hodný kluk, ale jeho rodiče jsou členy jakési sekty a nechtějí Kubíka nechat očkovat. Nejraději by ho měli pořád doma, ale nakonec ho kvůli práci přece dali do školky… nPo měsíci ve školce začal být Kubík nachlazený, a nakonec se začal dusit a sípavě dýchat. Volali RZP, záchranáři už uvažovali o koniopunkci, nakonec ale nebyla nutná. Ukázalo se, že Kubík má zánět příklopky hrtanové – nemoc, která se dnes už moc často nevidí… http://www.kinderaerzte-im-netz.de Kdo to Kubíkovi udělal? nViník: Haemophilus influenzae ser. b (Hib) nHemofily jsou krátké gramnegativní tyčinky. Hemofily patří do čeledi Pasteurellaceae společně s rodem Pasteurella (viz dále) 28 Hib http://www.co.monroe.mi.us Klasifikace hemofilů nHaemophilus influenzae npouzderný typ b (Hib) – proti tomu se očkuje npouzderné typy a, c, d, e, f nneopouzdřené kmeny nHaemophilus parainfluenzae (mnohem běžnější a mnohem méně patogenní) nHaemophilus aphrophilus a mnoho dalších druhů nHaemophilus ducreyi, původce pohlavně přenášené choroby ulcus molle Patogenita hemofilů nNejzávažnější hemofilové choroby jsou epiglottitis, meningitis a sepse. Způsobuje je hlavně Haemophilus influenzae, serotyp b. nDalší časté choroby jsou otitis media a sinusitis (zde po Streptococcus pneumoniae a společně s Moraxella catarrhalis) nVelmi běžná je přítomnost hemofilů v krku, přičemž patogenní role je velmi pochybná. Zvlášť v případě Haemophilus parainfluenzae nepředpokládáme, že by byl patogenem. [USEMAP] Hemofilové onemocnění 10 Haemophilus-Type-b http://www.immune.org.nz 13 HIB_vaccine Ulcus molle nJe to pohlavní choroba, vyskytující se především v subtropických a tropických oblastech 20 180px-Chancroid_lesion_haemophilus_ducreyi_PHIL_3728_lores 21 Cancro2 22 Cancro 23 měkký vřed http://upload.wikimedia.org www.fmt.am.gov.br www.fmt.am.gov.br http://www.sexsygdom.dk Ulcus molle – měkký vřed (šankroid) – způsoben Haemophilus ducreyi Ulcus durum – tvrdý vřed (šankr) – jeden z příznaků syfilis, způsobené Treponema pallidum Příběh druhý nJana se zase jednou toulala v zahradách. Bohužel, jeden plot byl příliš rezivý a pes za ním příliš silný. Pes unikl ven a narazil právě na Janu. A tak skončila Jana s pokousanou nohou. nMajitelé prokázali, že pes je očkován proti vzteklině. Avšak v ráně se brzy objevil hnis. Ten pak byl poslán do laboratoře. A zločincem byla… Pasteurella multocida nPasteurella multocida. nJe běžnou flórou v psích tlamách. nU člověka způsobuje zejména zhnisání ran po pokousání psem či jiným zvířetem. nMá podobný charakteristický pach, podobný hemofilovému (někteří ho spíše přirovnávají k pachu starého hadru), ale na rozdíl od něj roste na krevním agaru (nikoli však na Endově půdě) nKolonie na krevním agaru vypadají jako něco mezi streptokokem a enterokokem, ale je rezistentní na vankomycin, což obvykle mikrobiologa „trkne“, zejména při současné citlivosti na penicilin Pasteurella multocida 19 pasteurella 18 encefalite_bovina_f4 [USEMAP] http://www.biologico.sp.gov.br http://library.thinkquest.org Klinická charakteristika – gramnegativní nefermentující bakterie Příběh třetí nPan Zápalka je pyroman. Nedávno na svou vášeň doplatil a nehezky se popálil. Nyní se mu popálenina zanítila. Leží na popáleninovém centru a je na tom velice špatně. Lékaři naštěstí pochopili, že běžná antibiotika jsou mu platná jako mrtvému zimník a provedli stěr. Díky tomu se podařilo najít cílenou terapii a pana Zápalku vyléčit – do doby, než zase něco zapálí a způsobí si další popáleniny. 09 Skin-Ecthyma PSAE http://faculty.plattsburgh.edu Kdo za to tentokrát může? nViníkem je Pseudomonas aeruginosa, nejběžnější bakterie ze skupiny gramnegativních nefermentujících baktérií nViníkem by stejně dobře mohla být i kterákoli jiná bakterie z této skupiny, např. Acinetobacter, Burkholderia cepacia nebo Stenotrophomonas maltophilia nTyto bakterie jsou většinou striktně aerobní, nefermentují, nýbrž degradují cukry aerobní respirací, a jejich adaptace na vnější prostředí se projevuje i jinak – často mají nízké teplotní optimum a často jsou pigmentované, tím vzdorují slunci ve vnějším prostředí 5 Zeleně pigmentovaný kmen Pseudomonas aeruginosa na MH www.medmicro.info (stránky ústavu), foto prof. Skalka Pseudomonas aeruginosa P.aeruginosa - kultivace - kmen napadený bakteriofágem. Klikni! www.medmicro.info (stránky ústavu) foto prof. MVD. Boris Skalka, DrSc. 04 280px-Pseudomonas 07 P 08 pseudo 05 P Výjimečný kmen pseudomonády s modrým pigmentem textbookofbacteriology.net textbookofbacteriology.net http://de.wikipedia.org www.uiowa.edu Patogenita G– nefermentujících nObecně: Jsou to bakterie z vnějšího prostředí, často rostlinné patogeny, „bakterie-zbabělci“, které si netroufnou na zdravého člověka. Jejich terčem jsou pacienti s popáleninami, klienti ARK, JIP, transplantačních center a podobně. nU dlouhodobě hospitalizovaných nezpůsobují jen infekce ran, ale často je nacházíme i např. v dýchacích cestách či dokonce v krevním řečišti. nJde tedy o důležité původce nozokomiálních nákaz nNěkdy je ale těžké odlišit pouhou kolonizaci od skutečné infekce – zvláště u povrchových ran často nemá smysl používat celkovou antibiotickou léčbu při nálezu některé z těchto bakterií U oslabených osob mohou způsobovat např. i zánět nehtového lůžka. 03 pseudomonas%20i%20nogl Island www.kvarts.is Autokasuistika as. Zahradníčka Pseudomonády napadají i jinak zdravé lidi při porušení anatomické kožní bariéry. Infekce však bývá jen lokální. n13. 1. 2006, pátek, Padang, Západní Sumatra, Indonésie: as. Zahradníček padá do nezakryté dešťové kanalizace s následkem poměrně velké rány sahající na tibiální okostici nO několik týdnů později: rána je intenzivně cítit pseudomonádou, která je následně z rány i vykultivována. Naštěstí je dobře citlivá nTerapie: lokálně gentamicin + polymyxin B (u infekcí ran je často účinnější lokální léčba než celková, i vzhledem k existenci biofilmu na povrchu rány) nTerapie úspěšná 151-05(33) Padang Photo O. Z. Příběh čtvrtý nLinda bylo ubohé děvče: trpěla vrozenou chorobou – cystickou fibrózou. nJejí plicní surfaktant se lišil od surfaktantu zdravých lidí. A tak byla často nemocná. nPosledně to byl Staphylococcus aureus. Tentokrát to bylo jiné: původcem byla Burkholderia cepacia, jedna z G– nefermentujících tyčinek Nefermentující a cystická fibróza nCystická fibróza je těžké, vrozené onemocnění plic s poruchou produkce normálního plicního surfaktantu. To vede ke změněným charakteristikám plic, včetně mnohonásobně zvýšeného rizika infekce nNejčastějšími původci jsou Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia a Staphylococcus aureus. Kmeny zpravidla získají polyresistenci a mnohé děti umírají velmi mladé. 42 cystic fibrosis 43 hdc_0001_0001_0_img0072 http://www.humanillnesses.com 44 4083-250px-cftreatmentvest2-cystic-fibrosis http://goldbamboo.com Další „nefermentující“: Pseudomonas fluorescens 31 PSFL http://www.bact.wisc.edu Podobná P. aeruginosa, ale typická fluorescence kolonií pod UV lampou Burkholderia cepacia Burkholderia cepacia způsobuje hnilobu cibule (Allium cepa), je to tedy typický rostlinný patogen 32 onion_compend http://www.apsnet.org 34 Burkholderia%20cepacia%20fig18 http://www.microbelibrary.org Burkholderia pseudomallei Burkholderia pseudomallei je původcem mellioidózy. Příbuzná B. mallei způsobuje zoonózu zvanou malleus čili vozhřivka (SK: sopľavka) 33 bpseud http://www.asm.org Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia je dlouhé jméno, ale snadno si ho zapamatujete: je to „úzké-výživy-jednotka maltózu-milující, čili „bakteriální panda“, místo bambusu žvýkající maltózu J 35 STMA 36 StenoMalto-BAP-24-h 37 Stenotrophomonas%20maltophilia%20fig20 http://www.scielo.cl http://clinicalmicrobiology.stanford.edu http://www.microbelibrary.org 40 acinetc1259th Acinetobacter sp. 38 Acinetobacter_calcoaceticus_04-2Tag-Columbia 39 ACBA http://www.bakteriologieatlas.de http://www.microbelibrary.org http://www.buddycom.com Z řečtiny: a-kineto- = „nepohyblivý“ Metabolismus bakterií a jejich vztah ke kyslíku nJak již víme, G– nefermentující bakterie provádějí aerobní respiraci. Porovnejme nyní dvě bakterie: nEscherichia coli žije ve střevě. Má dost živin, ale málo kyslíku (i když jiných plynů si užije dost J) preferuje fermentaci glukózy i jiných cukrů. Escherichia coli je fakultativně anaerobní. Některé další bakterie žijící ve střevě jsou striktně anaerobní. nNaopak pseudomonády mají kyslíku habaděj, ale živin málo. Volí tedy aerobní respiraci, která jim umožní to málo dostupných živin využít úplně. Pseudomonády jsou striktně aerobní Pseudomonas jako striktní aerob (na rozdíl od jiných) nPseudomonáda (I) je striktně aerobní bakterie, nikoli fakultativně anaerobní jako například Escherichia coli (kmen III), natož striktně anaerobní jako kmen II (Bacteroides fragilis, viz P07). Kmen Bujón VL-bujón Výsledek I roste neroste Striktně aerobní bakterie II neroste roste Striktní anaerob III roste roste Fakultativní anaerob [USEMAP] Diagnostika hemofilů a pasteurel Přehled metod použitelných k dopadení bakterií čeledi Pasteurellaceae nPřímé metody nMikroskopie – krátké G– tyčinky nKultivace – Pasteurellaceae nerostou na Endově agaru, hemofily dokonce ani na krevním (s výjimkou současné kultivace s jiným mikrobem) nBiochemická identifikace – je možno ji použít nAntigenní analýza – používá se u hemofilů (Hib) nDetekce DNA – rutinně se nepoužívá nNepřímé metody se téměř nepoužívají Odlišení čeledi Pasteurellaceae (diferenciální diagnostika) nGramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií nEndova půda: jak již víme, rostou na ní z klinicky významných jen enterobakterie, příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující tyčinky, to tedy znamená, že Pasteurellaceae nerostou nPasteurellaceae prozradí zápach a různé další vlastnosti (biochemické, citlivost na antibiotika) 11 HaemophilusInfluenzae K diagnostice hemofilů a pasteurel nPasteurely rostou na krevním agaru nHemofily na krevním agaru růst neumějí, protože si neumějí „otevřít“ krvinku nRostou tedy na čokoládovém agaru nNa KA rostou v přítomnosti takové bakterie, která jim krvinku „otevře“ (satelitový fenomén). Takovou bakterií je například zlatý stafylokok nMají droboučké kolonie, proto se používá disk k odclonění ostatních bakterií (bacitracin, ale ve vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu) http://www.uni-ulm.de Satelitový fenomén nJak už víme, hemofily potřebují faktory z erytrocytů, ale nejsou samy schopny je narušit. Narušení může obstarat nzahřátí agaru (čokoládový agar) npřítomnost jiného mikroba nSatelitový fenomén představuje tu druhou možnost, jak může hemofil získat faktory z krvinek. Znamená růst hemofila pouze kolem stafylokokové čáry. nPřítomnost satelitového fenoménu je důkazem, že jde opravdu o příslušníka rodu Haemophilus Hemofily – vlevo na čokoládovém agaru, vpravo jako satelit na KA Haemophilus sp. - kultivace na čokoládovém agaru . Klikni! ČA Haemophilus sp. - satelitový fenomén. Klikni! KA (satelit) www.medmicro.info (stránky ústavu) Ještě jednou satelit 26 satelit http://phil.cdc.gov Detekce hemofilů Klin9 Klin9a Hemofily jsou rezistentnější než bakterie běžné flóry, takže rostou uvnitř zóny, ovšem jen kolem stafylokokové čáry (satelitový fenomén) www.medmicro.info Růstové faktory hemofilů nHemofily vyžadují faktory z krvinek, avšak jejich potřeba konkrétních faktorů je specifická: nH. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD) nH. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin) nH. influenzae vyžaduje oba faktory. nPoužíváme disky s těmito faktory: jeden s faktorem X, druhý s V, a třetí se směsí obou. Test růstových faktorů hemofilů Jeden disk obsahuje faktor X, druhý faktor V, třetí směs obou HEAP HEIN HEPA H.influenzae - růst kolem disku s faktory X+V. Klikni! H.parainfluenzae - růst kolem disku s faktorem V a s faktory X+V. Klikni! H. influenzae (vlevo), H. parainfluenzae (vpravo) www.medmicro.info Antigenní analýza hemofilů nAntigenní analýza se u hemofilů provádí obdobným způsobem jako u jiných bakterií. Dnes jsou zpravidla k dispozici komerční soupravy, obsahující např. i latexové částice a další součásti nDříve se využívalo jevu tzv. koaglutinace se stafylokokem, kdy aglutinát byl hustší díky navázání stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi Antigenní analýza hemofilů – demonstrace výsledku nVýsledek se odečítá obdobně jako jiné aglutinační reakce. 49 stafaurex předělaný na hemofily koláž s použitím: www.microbes-edu.org Detekce druhu Pasteurella typickým vzorcem citlivosti nŽádné gramnegativní bakterie nejsou citlivé na vankomycin. Vankomycin lze použít jen u grampozitivních, avšak zde je silný: všechny streptokoky a většina stafylokoků a enterokoků je citlivá. nNa druhou stranu, jen málo bakterií je citlivých na penicilin, zvlášť mezi G– tyčinkami. nKombinace citlivosti k penicilinu a rezistence k vankomycinu je poměrně specifická pro rod Pasteurella. Testy antibiotické citlivosti nHemofily nerostou na MH agaru nZpravidla se používá Levinthalův agar (přefiltrovaný čokoládový agar), na kterém jsou zóny lépe viditelné než na klasickém čokoládovém agaru nV naší laboratoři se používá „hemofilový agar“, což je půda blízká agaru Levinthalovu Typická sestava antibiotik pro léčbu hemofilových infekcí Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna* Ampicilin (aminopenicilin) AMP 22 mm Ko-amoxicilin (am.+inhib.) AMC 18 mm Cefuroxim (cefalosp. 2G) CXM 20 mm Doxycyklin (tetracyklin) DO 29 mm Ko-trimoxazol (směs) SXT 16 mm Azithromycin (makrolid) AZM 12 mm [USEMAP] Diagnostika gramnegativních nefermentujících bakterií Přehled metod používaných u G– nefermentujících bakterií nPřímé metody nMikroskopie – většinou jsou to G– tyčinky, ale Acinetobacter je G– kok nKultivace – „nefermentující“ rostou na většině půd včetně krevního agaru. Jakožto glukózu nefermentující jsou většinou také laktózu nefermentující, ovšem kolonie některých z nich jsou kvůli pigmentaci poměrně tmavé nBiochemická identifikace – možná, ale je potřeba použít testy, zjišťující aerobní respiraci (ne fermentaci). Je také nutno použít sníženou teplotu a prodlouženou inkubaci nantigenní analýza, detekce DNA – rutinně se nepoužívají nNepřímé metody se používají zřídka Odlišení G– nefermentujících (diferenciální diagnostika) nGramovo barvení: Gram– tyčinky × jiné bakterie nEndova půda: rostou (více později) nNefermentující se odliší od enterobakterií/vibrií tím, že nefermentují glukózu. Typické pro G– nefermentující je chybění jakékoli změny na Hajnově půdě (zůstává červená, případná nahnědlá barva nevadí, je dána přítomností pigmentů) n Bližší určení jednotlivých rodů a druhů G– nefermentujících nPseudomonády se zpravidla poznají: nMají typickou vůni (mladé kultury) nTvoří pigmenty, nejčastěji zelené, někdy modré či rezavé. Nejlépe jsou viditelné na MH, ale trochu i na KA či Endově agaru nMají pozitivní oxidázu nOstatní nefermentující, případně sporné pseudomonády, musíme rozlišit biochemicky, například NEFERMtestem 24 (v kombinaci s oxidázovým testem) Pseudomonády na MH agaru a ostatních půdách nUvědomte si, že MH agar je sám o sobě téměř bezbarvý, resp. lehce nažloutlý. nVše zelené, co vidíte na agaru, je výtvorem pseudomonády, resp. jejího pigmentu pyoverdinu nNa KA a Endu se tvorba pigmentu projevuje méně, ale projeví se také. Na těchto půdách je zato typický perleťový lesk kolonií. Oxidázový test u nefermentujících nZ nejběžnějších G– nefermentujících tyčinek má Pseudomonas oxidázu pozitivní, Burkholderia zpravidla také; Stenotrophomonas většinou ne a Acinetobacter také nikoli. medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm 08 oxidase3 NEFERMtest 24 nPro přesnou biochemickou identifikaci G– nefermentujících užíváme většinou Nefermtest 24 (nebo podobný jiných výrobců). nJe to trojstrip (ne dvojstrip jako minulý týden) nKód se tu tvoří poněkud jiným způsobem: nprvní číslice je 0 (oxidáza –) nebo 1 (oxidáza +) ndalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C nsloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro případné další rozlišení P1010002upr nDo jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky pro čtyři kmeny, každý se identifikuje pomocí 24 reakcí NEFERMtest 24 www.medmicro.info (stránky ústavu), foto O. Z. Atb citlivost nefermentujících nG– nefermentující naopak rostou ochotně na nejrůznějších médiích nPro testování i léčbu používáme poměrně silná antibiotika, nevhodná pro léčbu infekcí způsobených běžnými bakteriemi nKonkrétně se tu používají ncefalosporiny 3. generace* (ale jen některé, tzv. „protipseudomonádové“, jako je ceftazidim) nprotipseudomonádové peniciliny, monobaktamy a karbapenemy* (imipenem, piperacilin/tazobactam) naminoglykosidy (gentamicin, amikacin) nfluorochinolony (ciprofloxacin, ofloxacin) npolypeptidy (kolistin) n*a jejich kombinace s inhibitory betalaktamáz Typická sestava atb používaných proti nefermentujícím bakteriím Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna* Piperacilin + tazobaktam* TZP 22 mm Gentamicin (aminoglykos.) CN 18 mm Imipenem (karbapenem) IPM 22 mm Ciprofloxacin (chin 3 gen) CIP 29 mm Ceftazidim (CS 3 gen) CAZ 16 mm Kolistin (polypeptid) CT 12 mm *protipseud. penicilin + inhibitor b-laktamázy P.aeruginosa - diskový test citlivosti na antibiotika. Klikni! www.medmicro.info Na obrázku je Pseudomonas aeruginosa pravděpodobně citlivá na všechna testovaná antibiotika; je to však možné jen proto, že jsou testována jen speciální protipseudomonádová léčiva. I tak se vyskytují polyrezistentní kmeny sekundárně rezistentní i k nim. Zejména producenti takzvaných metalo-betalaktamáz (MBL) jsou často citliví jen na amikacin a kolistin E-test - kapkový tvar inhibiční zóny. Klikni! www.medmicro.info Testování citlivosti je možné i E-testem (na obrázku) nebo mikrodilučním testem Konec 30 PSFL [USEMAP] http://www.scienceclarified.com Zánět středního ucha – otitis media (bonus) nČastý u dětí (krátká vodorovná Eustachova trubice) nPůvodci: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis nU chronických se mohou uplatnit i některé gramnegativní tyčinky nNutno odlišit záněty boltce a zevního zvukovodu: tady je původcem hlavně Staphylococcus aureus (jako u jiných zánětů kůže), léčba lokálně např. framykoin kapky [USEMAP] Otitis media 10 JAMA_Childrens_EarInfections_lev20_AcuteOtitsMedia_JPP_01 09 otitis media [USEMAP] http://www.medem.com/MedLB/article_detaillb.cfm?article_ID=ZZZPMV6D1AC&sub_cat=544 http://www.otol.uic.edu/research/microto/Microtoscopy/acute1.htm [USEMAP] Vyšetřování a léčba infekcí středního ucha nLéčba má smysl, pokud jde o skutečně prokázaný zánět (bolest, zarudnutí, horečka) a nereaguje na protizánětlivou léčbu nLékem volby je amoxicilin (např. AMOCLEN), alternativou může být ko-trimoxazol nVyšetřovat výtěr ze zvukovodu má smysl pouze po provedené paracentéze (propíchnutí bubínku) nJinak má samozřejmě smysl vyšetřit hnisavou tekutinu, která je při paracentéze odebrána