NA STOPĚ PACHATELE Díl jedenáctý: Pachatel v organizované skupině aneb Bakteriální biofilm Mikrobiologický ústav uvádí L Na úvod nMy jsme skvělá flóra běžná nk našemu člověku něžná nosídlíme povrchy nčíháme tu na mrchy n nScházíme se každý pátek nza účelem tvorby látek nz kterých vzniká biofilm npevnější než dub i jilm! n n(Píseň běžné flóry, in: O. Zahradníček – Advent v dutině ústní. Zkráceno) [USEMAP] Přehled témat Klinické případy spojené s biofilmem Základní charakteristika biofilmu Diagnostické a experimentální metody u biofilmu Obrázky biofilmu Bonus: Více o biofilmu Klinické případy spojené s biofilmem Příběh první (tentokrát skutečný) nMuž, 58 let, v roce 2001 zaveden kardiostimulátor, v roce 2002 opakovaně hospitalizován na interním oddělení s teplotami nejasné etiologie, vzestup zánětlivých markerů nV hemokulturách prokázán S. epidermidis s.velmi dobrou citlivostí nNěkolikrát dlouhodobě přeléčován vysokými dávkami antibiotik v kombinacích (oxacilin, gentamicin, rifampicin, cefazolin, cefalotin, klindamycin) nZpočátku vždy dobrá odezva, poté se objevují ataky teplot i v průběhu terapie. nPři transesofageálním vyšetření nález vegetace na komorové elektrodě o velikosti 1,5 × 1,5 cm. nKardiologové opakovaně odmítají odstranění kardiostimulátoru. Nasazena kombinace antibiotik oxacilin + gentamicin + rifampicin, pacient v dobrém klinickém stavu. nZnovu však dochází k vzestupu teplot a zvýšení CRP. Nasazena terapie vankomycin + rifampicin, po zlepšení stavu je pacientovi odstraněn trombus a vyměněna elektroda (pod clonou ATB), to vede k celkovému zlepšení stavu pacienta. Příběh – pokračování Viníkem byl biofilm nNeúspěch zvolené ATB terapie byl zapříčiněn tím, že nebyla brána v úvahu vysoká rezistence mikroba rostoucího ve formě biofilmu vůči těmto antibiotikům. nLéčba nebyla od samého začátku dostatečně razantní a nedošlo k eradikaci ložiska biofilmu. nTeprve odstranění elektrody (pod clonou ATB) došlo ke zlepšení stavu pacienta. F:\Documents\Biofilm\04 catheter_biofilm.gif webs.wichita.edu Příběh druhý nMichal byl 13letý kluk. Nenáviděl rodiče a rozhodl se udělat cokoli, co bude proti nim.. nRozhodl se, že jedna z metod boje s rodiči by mohla být blokáda všeho, co po něm rodiče chtějí. nA tak si přestal čistit zuby, udržovat pořádek ve svém pokoji a dělat některé další podobné věci. nBrzy ho ale začaly bolet zuby. Musel k zubaři, který konstatoval těžký zubní kaz. Zubařka mu zuby spravila, ale také nemilosrdně trvala na tom, že si musí začít zuby zase čistit, jinak že bude mít problémy znova – ne jen s ní (a ostatními z generace „vraťte-se-do-hrobu), ale hlavně s vlastními zuby. Zločincem byl n…opět přerostlý biofilm. nV ústní dutině je biofilm normální. Je dokonce užitečný: normální ústní flóra se organizována ve formě biofilmu, a tak se může bránit vnějším vlivům včetně patogenních agens nNicméně příliš přerostlý biofilm (jako výsledek příliš velkého množství zkonzumovaných cukrů a příliš malého čištění zubů) způsobuje, že biofilm se stává nepřítelem, místo aby byl přítelem pacienta. Biofilm utekl zubnímu kartáčku a stává se zdrojem kazu F:\Documents\Biofilm\10 carie_development.gif 3× webs.wichita.edu F:\Documents\Biofilm\08 ging_plaque_diagram.jpg F:\Documents\Biofilm\07 brush_failure.jpg [USEMAP] Základní charakteristika biofilmu Biofilm: co je to? nBiofilm je komplexní, organizovaná struktura nSkládá se z živých buněk (většinou bakterií), hmot jimi produkovaných (většinou polysacharidů) a kanálků nNení přítomen jen v živých organismech, ale i v prostředí. Například kámen, na které jsme uklouzli v létě v řece či rybníku, byl asi pokryt biofilmem. Biofilm je významný i například v potravinářství [USEMAP] Biofilm v řece F:\Documents\Biofilm\17 keevil-biofilm.jpg www.sbs.soton.ac.uk Různé obrázky biofilmu E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Tol 01.JPG Foto: Archiv of Veroniky Holé Biofilm na katetru Různé obrázky biofilmu E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Tol 01.JPG Foto: Archiv of Veroniky Holé Biofilm na katetru Bakterie Kanálek Katetr Polysacharidy F:\Documents\Biofilm\01 BiofilmWbWithLabels.jpg biology.fullerton.edu Vznik biofilmu nNa začátku je pevný povrch a plovoucí bakterie + nBakterie adheruje na povrch nNásleduje agregace dalších bakterií nBakterie začnou produkovat polysacharidovou matrix nAž vznikne třídimenzionální struktura zvaná biofilm n nBiofilm může být jedno- či vícedruhový E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Model.gif F:\Documents\Biofilm\02 biofilm.jpg Vývoj biofilmu biology.binghamton.edu Vývoj biofilmu, jiné schema F:\Documents\Biofilm\03 biofilm_formation.gif webs.wichita.edu Vývoj biofilmu F:\Documents\Biofilm\14 biofilm formation.gif www.ul.ie Vývoj biofilmu, jiné schema F:\Documents\Biofilm\12 biofilmtutorial.jpg www.uweb.engr.washington.edu Význam tvorby biofilmu u bakterií nBakterie mohou lépe regulovat početnost populace – v rámci biofilmu se totiž informují produkcí určitých látek (tzv. quorum sensing) nBakterie se stávají odolnější vůči vnějším vlivům, např.: ndesinfekčním prostředkům nantibiotikům nimunitní reakci hostitele n nBiofilm tvoří jak bakterie běžné flóry (z hlediska organismu spíše pozitivní), tak i patogeny. F:\Documents\Biofilm\19 biofilm.jpg Biofilm env.snu.ac.kr Mechanizmy ovlivňující rezistenci k antibiotikům nVliv povrchového náboje nSnížení růstové rychlosti nPenetrační bariéra nNehomogenní matrix nFenotypové odlišnosti nIntercelulární signalizace nImunitní mechanizmy... F:\Documents\Biofilm\15 biofilm.jpg Biofilm www.dms-online.de Eradikace biofilmu nAntibiotická léčba často potlačí pouze symptomy infekce způsobené buňkami uvolněnými z matrix biofilmu a jejich interakcí s imunitním systémem, buňky uložené v.matrix biofilmu není schopna zasáhnout. nK eradikaci biofilmu je možno využít vysokých koncentrací ATB či jejich kombinací (např. ATB zátka katétru), pokud léčba selhává, je nutno vyjmout ložisko biofilmu nV budoucnu se určitě budeme pokoušet přímo rozbít biofilm, například pomocí enzymoterapie F:\Documents\Biofilm\18 andes%20biofilm%20sem.jpg Kvasinkový biofilm www.ansci.wisc.edu Prevence nKatétry a kostní cementy nvyrobené z nové generace plastů (snížení rizika adheze a tvorby biofilmu) ns koloidním stříbrem a dalšími povrchově aktivními látkami ns antimikrobiálními substancemi, např. nminocyklin nrifampicin nProplachy katétrů nDodržování pravidel asepse, správné dekontaminační postupy apod. [USEMAP] Diagnostické a experimentální metody u biofilmu Biofilm a mikrobiologická diagnostika na) Průkaz biofilmu naa) fenotypovými metodami (Christensenova metoda, Kultivace na agaru s.kongo červení) n n n n nab) genotypovými metodami nb) Stanovení citlivosti bakterií v biofilmu k.jednotlivým antibiotikům (MBEC) nc) Zohlednění tvorby biofilmu při běžné bakteriologické diagnostice: např. při kultivaci žilních katetrů se volí specifické metody (viz dále) namísto klasického pomnožení v bujonu E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Dizertacka obrazky\CTT 01.JPG E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Dizertacka obrazky\CRA 02.JPG Foto: Archiv Veroniky Holé Mikroskopie orálního biofilmu nVedle oficiálních metod pro průkaz biofilmu existují i další možnosti, jak zviditelnit biofilm. nV případě orálního biofilmu: nGramovo barvení umožňuje pozorovat shluky bakterií (G+ i G- ) a případně buňky makroorganizmu (epitelie apod.). Polysacharidové hmoty zůstávají nezbarvené. E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\Obrazky na prezentace\Vladane\Foto na web\Alcian 02.JPG nBarvení alciánovou modří naopak umožňuje i znázornění polysacharidového materiálu, tj. nebuněčné části biofilmu, buňky jsou zde znázorněny negativním barvením Foto: Archiv Veroniky Holé Průkaz vlivu čištění zubů na orální biofilm E:\Pracovní\Mikrobiální biofilmy\Kapitoly kniha\Zuby\Obrazky\ zubní kámen 2.jpg E:\Binec\02 Fotky\Pracovní\detekce plaku - erytrosin.jpg nDobrovolník má připravený jodový roztok či tablety s barvivem barvícím zubní plak. nRoztok se nechá působit v dutině ústní cca 2 min. Foto: Archiv Veroniky Holé Foto: Archiv Veroniky Holé Kultivace bakterií tvořících biofilm nPokud bakterie tvoří biofilm, je doporučeno použít před vlastní kultivací materiálu speciální postupy nV případě kultivace centrálního venózního katétru s předpokládanou kolonizací existují dvě metody. Obě jsou výhodnější než klasická kultivace v bujónu, sonifikace je však ještě o něco lepší než Makiho metoda nKlasická kultivace v bujonu: Uvolní se bakterie v.planktonické formě. Bakterie ve formě biofilmu se uvolní málo nebo vůbec. Vzhledem k použití bujónu jako pomnožovací půdy nevíme nic o kvantitě (kontaminace × infekce). nSemikvantitativní metoda: Umožňuje nám zmapovat povrch katétru a semikvantitativně posoudit nález, nevypovídá však o bakteriích v lumen a bakterie se nemusí uvolnit z biofilmu. nSonifikace: rozrušuje biofilm na povrchu i v.lumen katétru. Vyočkování určitého objemu vzorku je kvantitativní metoda, takže dává možnost posoudit množství mikrobů. Možnosti Průkaz vlivu přítomnosti sacharidů na tvorbu zubního plaku nPrincip pokusu je jednoduchý. Na plastovém důlku (který imituje povrch zubu) je kultivována jedna z ústních bakterií při různých koncentracích glukózy a po různě dlouhé časové úseky nVzniklý biofilm je poté vizualizován genciánovou violetí a jeho intenzita je kvantifikována ve formě absorbance pomocí spektrofotometru Aby se zabránilo náhodné chybě, má vždy šest sousedních důlků stejné hodnoty koncentrace glc i času H:\Documents\Seropanl biofilm.bmp Staré a nové zkratky pro určování účinnosti antibiotik nMIC – minimální inhibiční koncentrace je pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba nMBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ a podobně. nMBIC – minimální biofilm inhibující koncentrace nMBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN Kontrola růstu Diagnostické možnosti – stanovení MBEC Foto: Archiv Veroniky Holé MBEC … minimální biofilm eradikující koncentrace (Existuje také hodnota: MBIC … minimální biofilm inhibující koncentrace – hodnota nepodporovaná všemi vědci) nZatímco MIC je metoda určující minimální ninhibiční koncentraci ATB u planktonické formy, nMBEC zjistí eradikaci bakteriálního biofilmu. nVypovídá tedy lépe o skutečném účinku antibiotika nna bakterie žijící ve formě biofilmu. nMBEC odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu (nepřítomnost živých buněk, nedochází ke změně pH média, důlek tedy zůstává červený) MIC versus MBEC C:\Nika\Pracovní\1.JPG Foto: Archiv Veroniky Holé Rozdíly v MIC, MBIC a MBEC– porovnání Zkratky antibiotik: pen – penicilin, oxa – oxacilin, ams – ampicilin/sulbactam, cmp – chloramfenikol, tet – tetracyklin, cot – kotrimoxazol, ery – erytromycin, cli – clindamycin, cip – ciprofloxacin, gen – gentamicin, tei – teikoplanin, van – vankomycin Diagnostické možnosti II. nHodnoty MBEC leží často nad break pointem pro daná antibiotika (bakterie jsou k.nim rezistentní) nHodnoty MBEC jsou také zpravidla několikanásobně vyšší než MIC nMikroby v biofilmu jsou zpravidla rezistentní i ke kombinacím antibiotik, jedinou možností potom zůstává vyjmutí biofilmového ložiska (katétru, ale i kloubních náhrad, zubních implantátů apod.) Konec C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Rodinné a jiné\2005\2005-12-19 Fotky Ančete Haraščete z kruhovky pětky\A2%20023.jpg [USEMAP] (Studentka K. C. před čtyřmi lety zapomněla index, takže zápočet pak dostala v hospodě J) Prezentace byla vytvořena ve spolupráci ing. Veroniky Holé, PhD., MUDr. Lenky Černohorské, PhD., a MUDr. Ondřeje Zahradníčka Foto: Archiv O. Z. Bonus: více o biofilmu Kde všude působí biofilm problémy nbiofilm vzniklý na umělých površích v organismu člověka i zvířete (katetry, implantáty a podobně) nméně často biofilm na přirozených površích (zde si s tím organismus spíše poradí), ale i zde mohou být komplikace (zubní plak člověka, biofilm v žlázovém epitelu vemene u krávy) na samozřejmě také biofilm na různých površích či v potrubních systémech mimo organismy, zejména ve vodárenství a potravinářství [USEMAP] [USEMAP] Materiály a místa nNa čem se tvoří: nnerez nhliník nsklo nteflonu nguma nplasty nNejčastější výskyt: mrtvá místa výrobního zařízení nventily nklouby ntěsnění napod. Použity texty z publikace: Petra Sedláčková, Petra Klodnerová, Miroslav Čeřovský: Metody inaktivace a odstranění biofilmu Jaké jsou možné problémy u průmyslových biofilmů nzdroj křížových, postpasteračních a poststerilačních kontaminací → znehodnocení potravinářských produktů, kažení potravin, popř. přenos nákaz potravinami nkoroze kovových částí zařízení nturbulence protékajících tekutých materiálů v průtokových trubkách nsnížení účinnosti a energetické ztráty v důsledku tvorby tepelné izolační vrstvy ve výměnících tepla [USEMAP] Biofilm jako zdroj dalšího šíření nPoté, co se biofilm vytvoří, uvolňují se z něj mikroorganismy, které pak mohou kolonizovat zase další povrchy, takže biofilm vzniká na dalších místech nNeodstraněný biofilm tedy představuje potenciální riziko pro vznik biofilmu na jiných místech [USEMAP] Účinnost na biofilm = účinnost na bakterie nÚčinnost chemických látek na biofilm jako celek je dána zcela jinými mechanismy a vlivy než účinek na bakterie samotné. Často se právě uplatňuje povrchový náboj nProto postupy méně účinné na jednotlivé bakterie mohou být účinnější na biofilm nU biofilmů v chirurgických ranách je například důležitější lokální ošetření rány (např. koloidní stříbro – povrchový náboj) než celkově podaná antibiotika [USEMAP] Odstranění biofilmu (obecně) nOdstranění povrchu (výměna zařízení, části potrubí apod.) je samozřejmě radikální krok. Otázkou je, zda se biofilm nevytvoří znovu, bude-li nová část stejné konstrukce nK mechanickému odstranění biofilmu lze přistoupit, pokud to umožňuje situace nZ fyzikálních metod lze použít např. ultrazvuk nChemická cesta je možná, je však nutné mít ověřeno, že příslušný postup (látka a koncentrace) na biofilm působí. Často se používají chlorové preparáty nKombinace různých postupů je též možná [USEMAP] Detergenty a desinfekce: možnost kombinace (v průmyslu) nÚčinná může být kombinace npůsobení detergentu, který rozpustí a rozruší organickou hmotu na povrchu biofilmu, následně nopláchnutí rozrušený biofilm odplaví, a tím obnaží mikroorganismy, a poté ndesinfekční látka pronikne dovnitř biofilmu a inaktivuje přítomné mikroorganismy nNebo lze využít prostředků, které mají účinek detergentu i desinfekčního prostředku; problém je v tom, že vlastní desinfekční účinek detergentů je spíše slabý. [USEMAP] [USEMAP] Je možná prevence? nŠanci pro prevenci dávají materiálové vědy, zejména makromolekulární chemie nPovrchy nejsou stejně náchylné ke kolonizaci; méně náchylné jsou zpravidla hydrofobní povrchy. I jednotlivé plasty se liší nV medicíně se již používají materiály se speciální povrchovou úpravou, případně dokonce napuštěné antibiotiky (to ovšem nelze v potravinářství připustit) [USEMAP] Další obrázky biofilmu F:\Documents\Biofilm\05 ileum_biofilm.gif [USEMAP] Biofilm v ileu webs.wichita.edu F:\Documents\Biofilm\06 prosthetic_biofilm.jpg Biofilm na protéze webs.wichita.edu [USEMAP] F:\Documents\Biofilm\13 biofilm.jpg [USEMAP] Biofilm ares.jsc.nasa.go F:\Documents\Biofilm\18 andes%20biofilm%20sem.jpg Kvasinkový biofilm www.ansci.wisc.edu [USEMAP] Biofilm F:\Documents\Biofilm\20 biofilm.jpg [USEMAP] commtechlab.msu.edu Shrnutí bonusového materiálu nBiofilm působí komplikace nejen ve zdravotnictví, ale i v jiných oborech nNejčastějším dalším oborem, kde se biofilm uplatňuje, je potravinářství nI zde ovšem existuje významná souvislost s lidským zdravím. Biofilm v technologických zařízeních se může stát zdrojem kontaminace potravin, případně vody [USEMAP]