NA STOPĚ PACHATELE Díl čtrnáctý: Opakování aneb Jak vyzrát na praktickou zkoušku Mikrobiologický ústav uvádí L Základní informace nStudent si vytáhne jeden z padesáti úkolů nKe každému z praktik jarního a podzimního semestru přináleží cca dva až čtyři úkoly. Některé úkoly náležejí k více praktikům (např. ASLO k neutralizaci i ke streptokokům) nNěkteré části praktik jsou sice mimo úkoly, nicméně studenti na ně mohou být tázáni J01+J02: mikroskopie. Musíte znát přípravu mikroskopického preparátu. nPokud máme kmen: nkápneme na podložní sklíčko kapku fyziolog. roztoku. nvyžíháme mikrobiologickou drátěnou kličku v plameni npo zchladnutí nabereme trochu hmoty bakterií nhmotu rozmícháme v připravené kapce nPokud máme vzorek: ntekutý vzorek na podložní sklíčko kápneme nnátěr na špejli buď rozmícháme ve fyziologickém roztoku, nebo (pouze u barvených preparátů) přímo natřeme na sklíčko Příprava nativního preparátu nV případě nativního preparátu kapku, ve které je vzorek či rozmíchaný kmen, nesušíme. Pouze přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme objektivy, které zvětšují např. 4 ×, 10 × či 40 ×. nNepoužíváme imerzní olej nPozor! Kdo namočí neimerzní objektiv do imerzního oleje, okamžitě končí a u zkoušky neuspěl!!! Nativní preparát – postup (u kmene) Nativní preparát Příprava barveného preparátu nNezapomeňte na přípravu před barvením, nezaměňujte fixaci a sušení preparátu! nVycházíme opět z kapky vzorku nebo kmene rozmíchaného ve fyziologickém roztoku. V tomto případě je lépe, když je kapka malá. nKapku necháme zaschnout. Můžeme tomu pomoci umístěním poblíž kahanu. nPo zaschnutí vzorek fixujeme tím, že sklíčko několikrát protáhneme skrz plamen kahanu, kontrolujíce hřbetem ruky teplotu. Jednoduché barvení Příprava barvených preparátů 7a: voda Gramovo barvení – princip Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se fialově Obarví se fialově Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se červeně Gramem se nebarvící bakterie se neobarví v prvním kroku kvůli absenci buněčné stěny (Mycoplasma) nebo proto, že jejich stěna je vysoce hydrofobní (Mycobacterium). Spirochety by se barvily gramnegativně, ale jsou velmi tenké, takže i je lze také vlastně považovat za „Gramem se nebarvící“ a Gram se v jejich diagnostice nepoužívá. Gramovo barvení – postup nGenciánová violeť = Sol. Gram-Nowy (20 –) 30 vteřin nLugol (20 –) 30 vteřin nAlkohol 15 (– 20) vteřin nopláchnout vodou – nezbytné!!! nSafranin 60 – 120 vteřin nopláchnout vodou nosušit sušítkem* z filtračního papíru nmikroskopovat jako v prvním úkolu Barvení pouzder sice není v úkolech, ale můžeme se vás na ně také zeptat! nV barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší; mikroskopista pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo. 05 Burri pathmicro.med.sc.edu Co ještě vědět nKromě zhotovení nativního preparátu a Gramem barveného preparátu se po vás také může chtít odečíst již několik hotových sklíček (nátěry ze vzorků). nZde se očekávají také vaše znalosti z pozdějších praktik (např. interpretace nálezu leukocytů ve sputu a obecně v klinickém materiálu, nález intraleukocytárních diplokoků v uretrálních výtěrech apod.) Dift1 P1010003 Mikroskopie vzorku Mikroskopie kmene Foto O. Z. J03: Kultivace Přeočkování agarové kultury Rozočkování Vyžíhejte kličku Naberte kmen Naočkujte první úsek Vyžíhejte kličku Už znovu nenabírejte kmen Naočkujte druhý úsek Vyžíhejte kličku Už znovu nenabírejte kmen Naočkujte třetí úsek Vyžíhejte kličku Už znovu nenabírejte kmen Naočkujte „hádka“ Pozor! nÚkol je těžší, než se zdá (zapomíná se na vyžíhání mezi jednotlivými kroky, nebo se zapomene na to, že čáry se musí křížit) nNaopak se nehodnotí technická dokonalost čar (je nám jasné, že nejste zkušení mikrobiologové ani laboranti) nJde tedy o pochopení (a případně i vysvětlení) principu křížového roztěru, ne o dokonalé technické provedení Půdy po vás chceme primárně tyto (z praktika J03) n1. bujon n2. VL-bujon n3. selenitový bujon n4. Sabouraud n5. Löwenstein-Jenssen n6. KA n7. Endo n8. MH n9. NaCl n10. VLA n11. XLD (a MAL) n12. ČA n13. Levinthal n14. Slanetz-Bartley S některými dalšími půdami se případně můžete u praktické zkoušky setkat také, ale spíše výjimečně a u jiných úkolů (speciální bakteriologie) J04: biochemická identifikace nV rámci jiných úkolů (speciální bakteriologie a mykologie) určitě musíte být schopni provést: nKatalázový test a testy s diagnostickými proužky (oxidáza, INAC, PYR) + znát kdy který použít nHajnovu půdu použít k odlišení nefermentujících od fermentujících tyčinek; další přesné vlastnosti Hajnovy půdy a MIU se nepožadují, i když jejich znalost není na škodu nJediný úkol čistě patřící k J04 je nodečtení biochemického testu typu ENTEROtest (dostanete vše potřebné a test odečtete; nic více, ale také nic méně; důležité je určit i procento pravděpodobnosti a index typičnosti) Provedení oxidázového testu Obrázek20 Foto: archiv MÚ ENTEROtest 16 (530 063 = E. coli, 99,89 %, Tin=1,00) 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 E 14 D 15 C 16 B 17 A První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l l l l l l l l l l l l l l l l – S l l l l l l l l l l l l l l l l ? S l l l l l l l l l l l l l l l l ? + – + + + – – – – – – – – + + + + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 5 3 0 0 6 3 J05 Dekontaminační metody nNutná znalost metodologického rozdílu nPokud chceme ověřit mez přežití bakterií, musíme je po odstranění testovaných extrémních parametrů přemístit do podmínek růstového optima a nechat je tam dostatečně dlouho. nV opačném případě bychom ověřili pouze mez růstu, nikoli mez přežití. Úkol: Vyhodnocení účinnosti desinfekce nNestačí jen říci, kolikaprocentní desinfekce je výsledkem testu, je také potřeba říci (a zdůvodnit!) že jde o baktericidní, nikoli bakteriostatickou koncentraci desinfekce. n(V agaru, na kterém se bakterie pěstuje, už žádná desinfekce není.) Další úkol Vyhodnocení účinnosti horkovzdušné sterilizace Rezistentní, sporulující bakterie 160 °C 170 °C 180 °C 20 min přežívá přežívá hyne 30 min přežívá hyne hyne 60 min hyne hyne hyne K oběma úkolům navíc npatří vytvoření dvojic z předložených lístečků (například spárovat „sterilizace kovu, který nesnese vlhké teplo“ a „horkovzdušná sterilizace“) nlístečky jsou v praktikárně k dispozici J06: Antimikrobiální látky Nutná znalost kvalitativních i kvantitativních testů atbpsae21 www.medmicro.info Difusní diskový test: odečíst, vysvětlit, že je kvalitativní Mikrodiluční test – odečtení nVčetně porovnání s breakpointy a vysvětlení interpretace P3160025ux Někdy se v důlcích mohou objevit bublinky – při odečítání si jich nevšímejte E-test – není samostatným úkolem, ale znát byste ho měli nHodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek etest etest www.uniklinik-ulm.de Betalaktamázy běžné i širokospektré I395 I395a Opět platí – nejsou přímo v úkolech, ale dotaz na ně být může Foto O. Z. Druhý způsob testování ESBL Mil02Pop Činí-li rozdíl mezi zónami kolem disků cefotaximu bez inhibitoru : cefotaximu s klavulanátem s ním více než pět milimetrů, je kmen považován za producenta (širokospektré) b-laktamázy. Totéž platí pro ceftazidim. Foto O. Z. Serologie – praktika J07 až J09 Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu)+ vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Interpretace – důležité znát! nPrůkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta nPrůkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: nMnožství protilátek (relativní – titr) a jeho změny v čase (dynamika titru) nTřída protilátek: IgM/IgG (pouze u reakcí se značenými složkami!) n(Avidita protilátek) Musíte znát principy jednotlivých reakcí nPrecipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolekul (jde tedy o koloidní antigen) nAglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby, říkáme, že antigen je korpuskulární) nAglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na cizí částici – nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza) Komplementfixace C:\Uživatel\Ondra\Pracovní věci\Výuka\Výukové materiály\Medici\KFR.JPG Neutralizace nProtilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Červená Karkulka bez protilátky.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Červená Karkulka s protilátkou.bmp Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Toxin či virus Toxin či virus Protilátka + – Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Příklady neutralizačních reakcí Neutralizován Objekt Reakce Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO Virus Erytrocyt shlukování HIT Virus Buňka efekt metabolický VNT Reakce se značenými složkami Laboratorní protilátka Hledaný antigen Antigen chybí Značená laboratorní protilátka (àdetekce) Značená laboratorní protilátka + – Není navázaná je odplavena nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii) Pacientův vzorek Laboratorní protilátka Western blotting – princip n1: původní antigen (směs) n2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem n3: elektroforetické rozdělení antigenů n4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu n5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Western blotting.bmp Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Western blot. Klikni! Imunochromatografické testy nImunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent podobně jako předchozí nDůležitým rozdílem je, že zde není promytí. Některé komponenty jsou navázány na povrch na určitých místech (testovací a kontrolní místo), další se hned naváží na testovanou složku a spolu s ní cestují porézní vrstvou. V pozitivním případě je zpravidla pozorován proužek u testu i u kontroly, v negativním jen u kontroly. U průkazů antigenů nUmět provést a vyhodnotit sklíčkovou aglutinaci (například průkaz EPEC); u průkazu EPEC vysvětlit, za jakých okolností a proč se test provádí; uvést další příklady aglutinace k antigenní analýze nPopsat video „aglutinace likvoru“, ale především vysvětlit, kdy, jak a proč se používá, jaká je další rychlá metoda průkazu původců meningitid, a které naopak trvají delší dobu nHlavně vědět, že (a proč) se tu nikdy neurčují titry, natož IgG a IgM! Sklíčková aglutinace Clumping faktor U průkazů protilátek: Vědět, jak vypadají výsledky (např. u aglutinace v mikrotitrační destičce bramborák je pozitivita, tečka negativita) TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - Mikroprecipitace nTzv. mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho + - - - Do důlku uprostřed je nalita tekutina obsahující antigen. Ten difunduje agarem. Obsahuje-li sérum protilátky, difundují proti němu a na jejich styku vznikne precipitační linie. Musíte vědět, jak určit titr, případně dynamiku titru, a vyhodnotit nK+ pozitivní, titr = 1 : 200 nČ. 1 negativní nČ. 2 pozitivní, tit. = 1 : 400 nČ. 3 negativní nČ. 4 pozitivní, titr = 1 : 200 1:100 1:200 1:400 1:800 (a také kdy se titry neurčují a proč) U reakcí se značenými složkami nUmět vyhodnotit reakci ELISA; vědět, že destička se odečítá spektrofotometrem; když dostanete informace, jak určit cut off, být schopni určit negativní a pozitivní hodnoty a interpretovat (s ohledem na třídy protilátek) nZe stavebnice sestavit schéma průkazu HBsAg a anti-HBs při pozitivním a negativním průběhu reakce Například umět vyhodnotit BL 4 BL 4 K- 5 K- 5 K- 6 K- 6 K+ 7 K+ 7 K+ 8 K+ 8 1 9 1 9 2 10 2 10 3 11 3 11 c. o. (IgA) = (0,107 + 0,137)/2 + 0,320 c. o. (IgA) = 0,122 + 0,320 = 0,442 90 % c. o. = 0,398 110 % c. o. = 0,486 hodnoty pod 0,398 jsou negativní hodnoty nad 0,486 jsou pozitivní c. o. (IgG) = (0,034 + 0,029)/2 + 0,320 c. o. (IgG) = 0,032 + 0,320 = 0,352 90 % c. o. = 0,317 110 % c. o. = 0,387 hodnoty pod 0,317 jsou negativní hodnoty nad 0,387 jsou pozitivní HLEDEJTE POZITIVNÍ A HRANIČNÍ PACIENTY JAK V IgA, TAK I V IgG! IgA IgG A navíc ještě numět interpretovat nálezy dohromady (u borreliózy a toxoplasmózy – vyhodnotit dohromady nejen různé serologické reakce, ale také anamnézu) npamatujte si – pacient, který nemá protilátky, není „zdravý pacient“, pokud má potíže! je třeba např. odebrat znovu, odebrat protilátky proti jiné chorobě, provést jinou reakci apod. Pozor – ASLO a co o něm znát nPo každé streptokokové infekci se objevují protilátky, často včetně protilátek proti streptokokovému toxinu – streptolyzinu O. nNěkdy se však stane, že množství těchto protilátek po infekci neklesá, naopak stoupá. Protilátky se totiž vážou na některé struktury hostitelského organismu (autoimunita), roztáčejíce „bludný kruh“. nV takovém případě jsou tedy paradoxně nebezpečnější protilátky než patogen, proti kterému nás měly chránit. J10: PCR a jiné průkazy DNA/RNA nNení nutno znát detaily principu, ale je potřeba vědět, kdy a jak se používají v mikrobiologii nTyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není vůbec možný nNehodí se příliš pro běžné patogeny přítomné ubikvitárně. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí nMetody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní Nutno znát interpretaci PCR Vlastní reakce Interní kontrola Interpretace negativní pozitivní negativní negativní negativní inhibice reakce pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní negativní (vysoce) pozitivní pcrtbc upravený Třeba Pacienti 1 a 4 – pozitivní, pacient 2 – negativní, pacient 3 – inhibice reakce. 5 – pozitivní kontrola, 6 – negativní kontrola, 7 – ladder ß Vlastní reakce ß IC J11+J12 Virologie nVětší část virologie je totožná se serologií (průkaz HBsAg a podobně) nNavíc: přímý průkaz viru na vaječných zárodcích a buněčných kulturách (a na sajících myšatech, teoreticky) nNutno znát: kdy je a kdy není vidět výsledek izolace viru, a co se dá dělat, když výsledek vidět není (hemaglutinace, hemadsorpce) Nutno znát části oplodněného vejce… 01 Schéma vajíčka AM – amniový vak, YS – žloutkový vak, AL – allantois CH – chorioallantoidní membrána (CAM) SH – skořápková (papírová) membrána AB – bílek http://www.scielo.cl/fbpe/img/bres/v38n4/fig02.gif 01 slide05 10 MLEC www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/cellculture.php?menuID_=122 (HSV je virus prostého oparu – HSV 1 způsobuje zpravidla herpes labialis, HSV 2 herpes genitalis) Takže tady CPE je… ...a tady není …a zhruba tušit něco o CPE J13: Parazitologie. Znát tato vejce: nAlespoň tyto tvary byste měli znát ke zkoušce eggs Škrkavka Tenkohlavec bičíkový taenia1 Roup Mrľa Enterobius Škrkavka Hlísta Ascaris Tenkohlavec Trichuris Tasemnice Pásomnica Taenia + články! Obrázky převzaty z CD-ROM „Parasite-Tutor“ – Department of Laboratory Medicine, University of Washington, Seatle, WA Znát metody diagnostiky střevních parazitů nJako základ se používají metody, které představují v podstatě nativní preparát v různých modifikacích nU metody dle Kato se používá dobarvení pozadí malachitovou zelení, aby se paraziti zvýraznili nFaustova metoda je koncentrační (viz dále) nGrahamova metoda se používá jen u roupů (umět odečíst i prakticky) nNativní preparát „sensu stricto“ a barvené preparáty (např. trichromem) se použijí u zvýšeného podezření na střevní prvoky (buďto primárně, nebo po prohlédnutí Fausta a Kato) Pozor – také dg. Toxoplasma gondii serologickými testy nJak již bylo řečeno, u tkáňových parazitů se často používá nepřímý průkaz nKFR. První důlek je test antikomplementarity séra , ve druhém ředění 1 : 5, dále geometrickou řadou (1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80 atd.). Pozitivní je nepřítomnost hemolýzy, negativní je hemolýza nELISA – způsob výpočtu: co je vyšší než (C1+ D1) : 2, je pozitivní. A1 je blank, B1 negativní, E1 pozitivní kontrola. Popis pacientů dát dohromady s výsledky serologie a vyhodnotit nP: zdravá těhotná žena, doma kočky nQ: jiná těhotná žena, bez koček nR: mladá dáma toulající se v lesích; bez koček, zato však v kontaktu s prostředím kontaminovaným trusem divokých zvířat nS: senior, pracující v zahradě, po které se procházejí kočky C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Z internetu\Medici\Paraziti\11 Toxoplasma_LifeCycle.gif P01 až P06 a P10 (většina speciální bakteriologie a kvasinky) nJednotný typ úkolů: „Z předložených kmenů vyberte kmen … (např. stafylokoka), blíže určete, popř. také určete test citlivosti na antibiotika“ nÚkol z větší části teoretický (Gramovo barvení se nedělá, jen se o něm hovoří), ale některé části (kataláza, oxidáza) se mohou provést i prakticky, je-li na to čas nDůležité je znát a dodržet algoritmus – postupovat od obecného k detailnímu U stafylokoků například začít Gramovým barvením a pokračovat dále až k určení S. aureus http://www.ratsteachmicro.com/Staphylococci_Notes/HCOE_CAI_Review_Notes_Staphylococci.htm 29 Gram_Positive_Flow_Chart zmenšeno a inverze Enterococcus či (nebo další testy) Výjimky: nASLO se zkouší jako serologický úkol, plus znalost specifického významu tohoto testu (viz u serologie) nGrampozitivní tyčinky se zkoušejí jinak – student si prohlíží obrázky G+ tyčinek a má určit, který obrázek morfologicky odpovídá korynebakteriím, plus odpoví na doplňující otázky (např. „co by to mohlo být, kdyby to nedělalo palisády a rostlo by to při 4 °C?“) nZvláštní úkoly se také týkají anaerobů, mykobakterií a spirochet Korynebakteria, tvary diftmik2 diftmik2a www.medmicro.info, foto O. Z. P08: Anaeroby popis anaerostatu Anae3 vzduchotěsné víčko palladiový kalalyzátor (pod víčkem) konstrukce pro ukládání Petriho misek Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) šroubovací uzávěr tlakový ventil www.medmicro.info, photo O. Z. Anae1 www.medmicro.info, photo O. Z. 39 tetanus http://www.geocities.com Morfologie Clostridium tetani (praktické poznání od jiných bakterií) Plus: znát i další metody, znát půdy pro anaerobní kultivaci aj. nPokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu. U tetanu se myš svíjí v křeči, u botulismu jsou naopak patrné parézy. U toxinu Clostridium perfringens se pokus na zvířeti nepoužívá, zde využíváme kultivační průkaz lecitinázy na žloutkovém agaru. 70 myš tetanus jen malá Tetanická myš microvet.arizona.edu U toxinu Clostridium difficile využíváme imunochromatografický test. P08: Acidorezistentní bakterie Znát Ziehl-Neelsena nV prvním kroku barvíme karbolfuchsinem (Gabbetem) za horka až do výstupu par. Bez zahřívání by mykobakteria nešlo obarvit, leda při použití koncentrovanějšího karbolfuchsinu. nV druhém kroku odbarvujeme cca 15 s „kyselým alkoholem“, což je směs alkoholu s minerální kyselinou, nejčastěji kyselinou chlorovodíkovou, poté opláchneme vodou nVe třetím kroku dobarvujeme pozadí, tj. vše, co jsme ve druhém kroku odbarvili. Dobarvujeme cca 30 s malachitovou zelení nebo metylenovou modří. Opět opláchneme, osušíme a pozorujeme imerzí. nVýsledkem jsou červené acidorezistentní tyčinky na modrém nebo zeleném pozadí Jak se zkouší nMěli byste znát postup, plus vědět, jak vypadá pozitivní Ziehl-Neelsen a na základě toho umět odlišit jeho obrázek od jiných (například Gramem barvených preparátů) nPlus (stejně jako u dalšího úkolu) znalost ostatních metod u TBC, testování citlivosti, diagnostika aktinomycet a nokardií (rámcově) pro dodatečné dotazy 12 m_tub Ziehl-Neelsenovo barvení www.primer.ru Další úkol: Kultivace mykobakterií nVědět,že před kultivací musí být provedeno moření nZnát půdy (Šula, Banič a vaječné půdy Ogawovu či Löwenstein-Jenssenovu). nI pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají zátkou. Není to jen kvůli ohrožení personálu, ale především kvůli vyschnutí půdy. nVýsledky se odečítají po 1 (kontrola kontaminace) 3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace. (Pozitivní výsledky se obvykle nacházejí po šesti týdnech) P09 Spirochety: serologie + znát screening × konfirmaci, hlavně u syfilis Historický BWR – Bordet Wassermann Netr. Screeningové RRR – Rapid Reagin Test TPHA/TPPA Treponemové Konfirmační ELISA FTA-ABS (nepř. imunofluor.) Western Blotting Historický, popř. superkonfirmace TPIT (Treponema Pallidum Imobilizační Test) = Nelson Pozor! nTěhotné s pozitivním RRR nelze říct, že „má asi syfilis“, je potřeba vyšetření konfirmovat nNegativní nález serologie boreliózy u pacienta s erythema migrans neznamená, že bude považován za zdravého a nebude léčen ouchterlony P10 mykologie nPlus další úkol je mikroprecipitace v agaru nMorfologie vláknitých hub není přímo v úkolech, ale můžete na ni být také tázáni Důlky se séry pacientů 1–4 Důlek s antigenem pozitivní Precipitační linie – kvůli ní je to pozitivní Zkouší se jako např. stafylokoky P11 Biofilm Úkol posouzení vlivu sacharidů a času na biofilm nJako v praktiku, ale nekreslí se graf, jen se vysvětlí, včetně vysvětlení významu nPosuďte vliv příjmu různého množství sacharidů ve stravě na rychlost tvorby biofilmu u kariogenního Streptococcus mutans. nJaké závěry vyplývají z tohoto pokusu ohledně množství sacharidů ve stravě, délce jejich setrvání v dutině ústní apod.? Schema důlků Seropanl biofilm Další úkol – stanovení MBEC nNeplést zkratky nMIC – minimální inhibiční koncentrace je pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba nMBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ a podobně. nMBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace nZatímco MIC je metoda určující minimální ninhibiční koncentraci ATB u planktonické formy, nMBEC zjistí eradikaci bakteriálního biofilmu. nVypovídá tedy lépe o skutečném účinku antibiotika nna bakterie žijící ve formě biofilmu. nMBEC odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu (nepřítomnost živých buněk, nedochází ke změně pH média, důlek tedy zůstává červený) MIC versus MBEC 1 Foto: Archiv Veroniky Holé nZde jsou čtyři stejné úkoly: dostanete lísteček se třemi „minikasuistikami“. Vaším úkolem je rozhodnout se, jaké vyšetření provést a vybrat pro ně vhodné typy odběrových souprav. nDůležité je rozlišovat krev na hemokultivaci × krev na serologii, vědět, že u vaginálních výtěrů je vhodný CAT, ale také Amies, apod. P12 Klinická mikrobiologie I Některé typy výtěrovek 11 Abstrichbesteck-MEDI_SWAB Amiesova půda s aktivním uhlím www.herenz.de Univerzální transportní půda pro bakteriologii (všechny typy výtěrovek). Drátěná varianta je důležitá, pokud se potřebujeme „dostat za roh“. Suchý tampon www.calgarylabservices.com Dnes se používá jen pro PCR a průkaz antigenu, ne pro kultivaci! 12 PlainSwab Další výtěry 17 virus swab Na viry www.copanswabs.com 18 chlamydia swab Na chlamydie www.copanswabs.com Fungi Quick (na kvasinky a plísně) www.copanswabs.com Souprava C. A. T. (Candida And Trichomonas, pouze z genitálií www.copanswabs.com P1010011čb P1010011čb Nádobky Zkumavka sérová čb otočená bez popisu Sputovka čb otočená bez popisu Na střevní parazity čb otočený bez popisu Do toho se vychčije čb Běžná zkumavka. Universální použití: srážlivá krev (serologie), moč, likvor, hnis, punktát apod.; krevní a močové katetry, menší kousky tkání… Sputovka. Nejen na sputum, ale např. i na větší kousky tkání Nádobka na stolice – na parazitologii. Pouze tato nemusí být sterilní! Nádobka na odběr moče. Je lepší, když pacient čurá rovnou do zkumavky, avšak zvláště pro ženy je to obtížné (nejsou-li ve sprše). Mohou tedy močit do této nádobky, a pak sestra moč přelije do zkumavky. P13 Klinická mikrobiologie II nZahrnuje dva zrádné úkoly: nNajít patogeny mezi běžnou orofaryngeální mikroflórou (nutno vědět, která to je, a jak se tam patogeny hledají) nOdečíst semikvantitativní a kvalitativní vyšetření moče – nezapomenout, že určení kvantity je podmínka nutná, ale nikoli dostačující (je totiž ještě nutno zjistit, co to je za mikroba) Úkol 1: Záchyt patogena v krku či sputu Očkování výtěrů 1 očkováno tamponem 2 očkováno kličkou 3 stafylokoková čára 4 disk BH (bacitracin pro hemofily) 5 disk VK (vankomycin a kolistin pro meningokoky) Na celé naočkované ploše pátráme po streptokocích (bezbarvé) a po stafylokocích (spíše bílé či zlatavé) Kultivační výsledek výtěru z krku s běžnou flórou Klin7 Klin9a V těchto místech pátráme po hemofilech www.medmicro.info Semikvantitativní zpracování moče nPoužívá se kalibrovaná plastová klička – do očka kličky se zachytí vždy 1 µl moče nTento mikrolitr se rozočkuje většinou na polovinu misky krevního agaru (vy to máte na celé misce) nKolonie není třeba přesně spočítat, stačí odhadnout je-li jich více než 100, méně než 10 nebo „něco mezi“ Semikvantitativní hodnocení moče Počet kolonií na misce Počet CFU (bakterií) v 1 µl moče Počet CFU (bakterií) v 1 ml moče Hodnocení (platí pro 1 druh bakt.) Méně než 10 Méně než 10 Méně než 104 Kontaminace 10–100 10–100 104–105 Hraniční Více než 100 Více než 100 Více než 105 Infekce Nashledanou u zkoušky! kresba: Petr Ondrovčík SAU-maluvka