Přehled mikrobiologických vyšetřovacích metod Orální mikrobiologie – BHOM011s Týden 2 Ondřej Zahradníček Obdélníky a kulaté obdélníky O co se snaží laboratoř klinické mikrobiologie l1. Odhalit původce nemoci (patogena – ne tedy jakéhokoli mikroba náhodou přítomného v těle) l2. Někdy také: zjitit citlivost patogena na antimikrobiální látky (dělá se u bakterií a kvasinek, nedělá se u parazitů a vláknitých hub, u virů je to zatím ve fázi výzkumu) l3. Někdy také: určení faktorů virulence (např. u střevní anaerobní bakterie Clostridium difficile je nález bakteriálního toxinu (jedu) důležitější než samotný nález bakterie, která se v malých množstvím vyskytuje i ve střevě zdravých lidí a nemusí nutně škodit) Co potřebuje mikrobiologická laboratoř, aby mohla tyto cíle plnit? lVe většině případů pro zjištění patogena, jeho faktorů virulence a citlivosti na antimikrobiální látky, není potřebná přítomnost celého živého pacienta. Stačí, když se pacientovi odebere tzv. klinický vzorek lVzorek obecně je cokoli, co přichází do jakékoli laboratoře k vyšetření (například vzorek horniny, vzorek pitné vody, vzorek etanolu vyšetřovaného na přítomnost metanolu...) – v klinické mikrobiologii ale tyto vzorky nepřipadají většinou v úvahu, a proto se většinou pojem vzorek ztotožňuje s pojmem klinický vzorek Co může sloužit jako klinický vzorek lVzorek je tedy to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: lkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč, hnis...) lstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média lobčas i něco jiného (otisk tkáně, nátěr na sklíčko) lTypický je případ, kdy jako vzorek použito něco, co by mohlo/mělo obsahovat hledané patogeny (u močové infekce moč, u angíny výtěr z krku a podobně). Toto neplatí u tzv. nepřímého průkazu, o kterém bude řeč dále Typické vzorky v orální mikrobiologii lTypickým vzorkem v orální mikrobiologii je výtěr z dutiny ústní, zpravidla zanořený do transportní půdy, aby hledané mikroby neuhynuly lJe také možno posílat různé otisky a nátěry na sklíčka, a v případě hnisavých ložisek z okolí ústní dutiny také přímo hnis z těchto ložisek Pracuje mikrobiolog přímo se vzorkem? lV některých případech opravdu mikrobiolog může pracovat s celým vzorkem. Vzorek vhodným způsobem zpracuje a pozoruje v mikroskopu, hledá v něm tzv. mikrobiální antigeny nebo nukleovou kyselinu, nebo ho umístí na kultivační půdu k pěstování mikrobů lJindy je nejprve nutno ze vzorku (který obsahuje i pacientovy buňky a mikrobů tam může být víc najednou) izolovat čistou kulturu jediného mikroba (většinou bakterie nebo kvasinky) – takové čisté kultuře říkáme kmen Co je to kmen lKmen je čistá kultura („výpěstek“) mikrobů, vzniklá (teoreticky) z jedné buňky. Všechny buňky patřící ke stejnému kmeni mají stejné vlastnosti (kdežto v rámci jednoho druhu můžeme mít různé kmeny, trochu se vlastnostmi lišící) lKmen nám nahrazuje jedince tam, kde s jedincem nemůžeme pracovat (např. metabolismus jedné buňky není reálně možné testovat) lKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. lKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. V praxi (vyšetření sputa*) lVzorek sputa à práce se vzorkem (kultivace, mikroskopie, popř. další) l –Kmen zlatého stafylokoka à práce s kmenem (bližší určení různými metodami, testování citlivosti na antibiotika) –Další kmeny à podle vzhledu patří k běžné mikroflóře, a tak s nimi už dále nepracujeme *česky chrchel Přehled metod lMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt –Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým klinickým vzorkem –Identifikace kmene – určení kmene (izolátu) vypěstovaného na pevné půdě lMetody nepřímé: Hledáme výsledky imunitní reakce pacientova těla, většinou protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace* ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne** *a další podobné identifikační metody **netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů 1. Mikroskopie Co vidíme v mikroskopu lV případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk (například samé fialové kuličky nebo červené čárky) lV případě mikroskopování vzorku můžeme vidět –mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů –buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty a další buňky –jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Typy mikroskopie lElektronová mikroskopie – u virů; spíše výzkum než při běžném průkazu virů lOptická mikroskopie –Nativní preparát – na velké a/nebo pohyblivé mikroby –Nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety), fázový kontrast a další fyzikální varianty –Fixované a barvené preparáty, například: lBarvení dle Grama – nejdůležitější bakteriologické lBarvení dle Ziehl-Neelsena – např. u bacilů TBC lBarvení dle Giemsy – na některé prvoky lFluorescenční barvení U barvených preparátů se obvykle používá tzv. imersní systém (mezi objektiv a sklíčko se kápne imersní olej) Gramovo barvení – princip 1 lGrampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. –Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť… –…a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem… –…se neodbarví ani alkoholem. lGramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem. Gramovo barvení – princip 2 Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se fialově Obarví se fialově Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se červeně Jiné bakterie než klasické G+ a G– bakterie: Mykobakteria jsou acidorezistentní. Jejich stěna je hydrofobní. Nebarví se ani fialově, ani červeně; nebarví se vůbec. Někdy je označujeme jako „gramem se nebarvící bakterie:“ Mykoplasmata nemají buněčnou stěnu vůbec, avšak jejich cytoplasma se barví slabě na červeno. Nicméně jsou mizerně viditelná (také protože jsou velmi malá) a Gramovo barvení se pro ně nepoužívá. Spirochety mají gramnegativní typ buněčné stěny, ale jsou tak tenké, že jsou špatně vidět a Gramovo barvení se u nich zpravidla také nepoužívá. Dift1 P1010003 Mikroskopie vzorku Mikroskopie kmene Foto: archiv MÚ 2. Kultivace Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) lBakterie často pěstujeme na umělých půdách lBakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) lZa 24 (někdy až 48) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly lVláknité houby se pěstují mnohem déle lViry a paraziti se většinou vůbec nepěstují Kultivace bakterií – podmínky lBakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod. lNěkteré (teplota) jsou dány nastavením termostatu, jiné (procento solí) složením kultivační půdy lPoužíváme různá kultivační média, sloužící k určitým účelům lAerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry lStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku. Kapnofilní zase zvýšený podíl CO2. lPřipravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce P1010008 Foto: archiv MÚ Smysl kultivace bakterií lProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? –Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) –Abychom získali kmen – pouze pevné půdy –Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci Kultivace v praxi lVzorek se vloží do tekuté půdy nebo nanese na pevnou půdu lU pevné půdy se ho snažíme tzv. mikrobiologickou kličkou rozředit, abychom získali jednotlivé kolonie (co je to kolonie – viz dále) a mohli dále pracovat s kmeny mikrobů lTekuté půdy –jsou půdy pomnožovací –základem je zpravidla hovězí vývar a bílkovinný hydrolyzát –nejdůležitější je peptonová voda, bujón, VL-bujón, selenitový bujón (selektivně pomnožovací) Tekuté půdy P1010001 Foto: archiv MÚ Hemofil na ČA Pevné (agarové) půdy lAbychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. •Základem je opět masopeptonový bujón, ale navíc obsahují výtažek z agarové řasy. Používala se i želatina, ale neosvědčila se tolik jako agar. Foto: www.medmicro.info V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Rozočkování 1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až na konci izolované kolonie Pojem kolonie lKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) lKolonie je tedy vždy tvořena jedním kmenem. lV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) lPopis kolonií má významné místo v.diagnostice S3 Foto: archiv MÚ Co se dá popisovat u kolonií lVelikost lBarva lTvar (okrouhlý…) lProfil (vypouklý…) lOkraje (výběžky..) lPovrch (hladký, drsný) lKonzistence (suchá…) lPrůhlednost lVůně/zápach lOkolí kolonie To vše ale pouze v případě, že se podařilo rozočkováním získat jednotlivé kolonie. Tam, kde je hustý nárůst, se většina těchto vlastnosti hodnotit nedá. Kult5 Pevné půdy Foto: archiv MÚ Existují různé typy pevných půd lDiagnostické půdy – roste "kdeco, ale různě" (krevní agar, VL krevní agar) –Chromogenní půdy – zvláštní druh diagnostických půd lSelektivní půdy – roste "jen málo co" (krevní agar s 10 % NaCl pro kultivaci stafylokoků) lSelektivně diagnostické půdy – např. Endova (rostou tam jen některé G– bakterie = selektivita + rozlišení bakterií podle štěpení laktózy = diagnosticita) lObohacené půdy – k pěstování náročných baktérií (čokoládový agar, což je zahřátý krevní agar) lSpeciální půdy – mají své zvláštní určení (MH půda pro testy citlivosti kmene k antibiotikům) Kult6 Půdy diagnostické lNepotlačují růst žádného mikroba lZato díky svému složení rozlišují mikroby podle určité vlastnosti lPříkladem je krevní agar ke sledování hemolytických vlastností a VL krevní agar (podobný, ale na anaeroby) lZvláštním případem půdy chromogenní a fluorogenní Hemolýzy Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Pevné selektivní půdy lÚčelem je selektovat (vydělit) ze směsi baktérií pouze určitou skupinu nebo skupiny lPříkladem je agar pro stafylokoky s 10 % NaCl. (Oproti 0,9 % u běžného agaru. Je logické, že na této půdě rostou právě stafylokoky. Jsou to totiž kožní bakterie, zvyklé na život v kůži, občas i zpocené a slané.) lNěkdy je selektivnosti dosaženo přidáním antibiotika. Krevní agar s amikacinem je selektivní pro streptokoky a enterokoky Selektivita hypersolného agaru 6,5 % 10 % Většina Enterokoky Stafylokoky Příklad selektivně diagnostické půdy – Endova půda lEndova půda umí také rozlišit bakterie podle toho, jestli dovedou štěpit laktózu, nebo ne (diagnostická vlastnost). Kult9 Endova půda je selektivní jen pro některé gramnegativní tyčinky (selektivní vlastnost) Foto: archiv MÚ Půdy se používají i k testování citlivosti na antibiotika atbstau17 atbpsae21 lV tomto případě se bakterie naočkují po celé ploše a na půdu se nakladou kulaté papírky napuštěné jednotlivými antibiotiky (antibiotické disky). Antibiotika difundují agarem. Je-li kmen citlivý, vytvoří se zóna citlivosti. lNejčastěji se používá bezbarvá MH půda, na které je zároveň dobře vidět i pigmenty bakterií Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Postup očkování výtěru z krku Očkování výtěrů 1 očkováno tamponem 2 očkováno kličkou 3 stafylokoková čára 4 disk BH (bacitracin pro hemofily) 5 disk VK (vankomycin a kolistin pro meningokoky) Na celé naočkované ploše pátráme po streptokocích (bezbarvé) a po stafylokocích (spíše bílé či zlatavé) Výtěr z krku – reálný výsledek vytkrk Foto: archiv MÚ Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae3 Anaerobní bakterie nesnášejí kyslík. Musíme je tedy pěstovat ve speciální atmosféře bez kyslíku. Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ 3. Biochemická (a jiná) identifikace kmenů Biochemické identifikační metody lObecný princip je téměř vždy stejný: Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt(y). Produkt(y) se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor lExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. lI mezi savci jsou rozdíly: člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano. Nedivme se tedy, že existuje tolik rozdílů mezi bakteriemi. Možnosti praktického provedení lRychlé testy (vteřiny až minuty) –Katalázový test –Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) lTesty s inkubací (hodiny až dny) –Jednoduché zkumavkové testy –Složité zkumavkové testy –Sady jednoduchých zkumavkových testů –Testy v plastové destičce (miniaturizace) –Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test lKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 14 catalase medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm 08 oxidase3 Příklady dalších testů: oxidázový test (diagnostický proužek) medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Provedení testu v praxi Obrázek20 Foto: archiv MÚ 11 indole …a další testy 15 urease2 medic.med.uth.tmc.edu Moderní biochemické testy zahrnují i desítky reakcí lTesty se dělají v důlcích plastových mikrotitračních destiček. lPočet testů v sadách kolísá od sedmi až po více než padesát lLiší se v technických detailech. Vždy je však substrát usušený nebo lyofilizovaný, bakterie se nejprve rozmíchá ve fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků – tím okamžikem začne reakce NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr Foto: O. Z. Zahraniční soupravy 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 Foto: O. Z. http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. 02 API systémy www.ucd.ie/kyr/Images/jpgs/Photo16.htm Další identifikační metody lNe všechny identifikační metody jsou založeny na principu substrát à produkt. lK identifikaci kmene lze využít například typickou citlivost na antibiotika, ovlivnění růstu jedné bakterie druhou, růst při určitých teplotách, testování pohybu a podobně. lV poslední době se prosazují nové metody, například hmotová spektrometrie typu MALDI-TOF, kde se hodnotí ionty vzniklé z proteinů typických pro jednotlivé druhy bakterií či kvasinek. lIdentifikace antigenní analýzou kmene bude probrána dále. Většinou se používá k vnitrodruhové identifikaci (např. odlišení tzv. EPEC od běžných E. coli) Například zde se zkoumají i vzájemné interakce (ovlivnění způsobu růstu) dvou různých bakteriálních kmenů Obrázek18 Foto: archiv MÚ P1010041 MALDI-TOF Příprava kmene pro MALDI-TOF P1010045 4. Pokus na zvířeti Pokus na zvířeti lPokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Jsou už jen výjimečné případy, kdy se uplatní i dnes. newzealand7 www.rockinjawrabbits.com/newzealand.htm 5. Průkaz nukleové kyseliny Průkaz nukleové kyseliny lmetody bez amplifikace nukleové kyseliny (např. klasické genové sondy) lmetody s amplifikací (namnožením) –PCR (polymerázová řetězová reakce) –LCR (ligázová řetězová reakce) lPrincipiálně se použití v mikrobiologii neliší od použití jinde (např. v genetice) lNevýhoda – někdy jsou až příliš citlivé, takže se prokáže každá molekula DNA, která mohla třeba „přilétnout odněkud zvenčí“. Citlivost se dnes ale dá omezit. Praktické poznámky lVzorky, které budou zkoumány metodou PCR, se odebírají poněkud jinak, než vzorky ke kultivaci. Mikrob nemusí nutně přežít, zato je důležité –aby DNA nebyla kontaminovaná nějakou DNA zvenčí –aby vzorek neobsahoval nějakou látku, která přivodí tzv. inhibici reakce lProto se zpravidla používá suchý tampon, nikoli tampon s transportní půdou lJe nutno pracovat sterilně, a je nutno používat netalkované rukavice (talek může inhibovat reakci) 6. Průkaz antigenu + průkaz protilátky Metody založené na interakci antigen – protilátka lO antigenech a protilátkách bude ještě řeč, až se budou probírat základy imunologie. lProzatím si pouze představíme v hrubých rysech mikrobiální antigen a protilátku proti němu, abychom si pak ukázali, jak se jejich vzájemná interakce využívá v diagnostice Antigen a protilátka lCo je to antigen? Antigen je struktura na povrchu (například) mikroba, která tělo provokuje k tvorbě protilátek lA co teď pro nás bude důležité: Antigen reaguje s protilátkou, která se proti němu vytvořila; reakce (vznik takzvaného „komplexu“) je buď přímo vidět, nebo ji můžeme nějakým způsobem detekovat. lPlatí tedy, že antigen se dá prokázat pomocí protilátky, která se proti němu vytvořila například u zvířete Podobně to ovšem platí i pro protilátku: lProtilátka se dá prokázat pomocí specifického antigenu, proti kterému se vytvořila lNesmíme ale zapomínat na to, že protilátka není žádná část mikroba. Je to bílkovina, imunoglobulin, produkt imunitního systému člověka (nebo zvířete). lReakce „antigen – protilátka“ se tedy dají využít ke dvěma různým věcem: k průkazu antigenu (který patří do přímého průkazu) a k průkazu protilátky (ten patří do průkazu nepřímého) Ještě jednou – co je to tedy antigen a co je to protilátka: lAntigen je struktura na povrchu mikroba (ale i třeba pylového zrnka či zvířecího chlupu), které tělo provokuje k tvorbě protilátek lProtilátka je bílkovina (gamaglobulin, imunoglobulin), která vznikla v hostitelském organismu, který byl „drážděn“ antigenem Serologické metody (založené na interakci antigen – protilátka) lpracují s reakcí antigen – protilátka (za vzniku komplexu); vzájemně se liší způsobem detekce komplexu antigen – protilátka lpři stejném principu metod se dají využít pro průkaz antigenu (pomocí zvířecí protilátky) i pro průkaz protilátky v těle pacienta (pomocí antigenu mikroba, nebo i celého mikroorganismu) Využití k průkazu antigenu lV tomto případě postupujeme následovně –použijeme vzorek, který jsme získali od pacienta a ve kterém hledáme bakterii, –případně místo vzorku použijeme už čistý kmen bakterie z toho vzorku, který ještě nemáme přesně určený –s tímto vzorkem nebo kmenem smícháme laboratorní protilátku proti danému antigenu (dříve se tyto protilátky získávaly od zvířat, dnes máme jiné způsoby, jak je získat) –sledujeme, jestli vznikne tzv. komplex Využití k průkazu protilátky lI když princip je stejný, postupujeme jinak: –použijeme laboratorní kmen určité bakterie (chceme-li prokázat protilátky proti yersiniím, vezmeme yersinii, případně její vyčištěné antigeny) –s tímto kmenem nyní smícháme sérum vyšetřovaného pacienta, ve kterém předpokládáme protilátky –v pozitivním případě (= pacient opravdu protilátky má) opět vznikne komplex Jak si to představit lNeznámý klíč mohu zkoušet strkat do různých zámků, abych zjistil, ke kterému z nich se hodí: testuji klíč pomocí různých zámků lNeznámý zámek mohu zkoumat tak, že do něj zkouším strkat různé klíče, abych zjistil, který klíč se k němu hodí: testuji zámek pomocí různých klíčů lPřitom není pochyb, že zámek je něco úplně jiného než klíč! Protilátku antigenem, nebo antigen protilátkou? Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Prokazování komplexu antigen-protilátka lReakce antigenu s protilátkou je někdy přímo viditelná (v dosud bezbarvé směsi se třeba najednou „udělají chuchvalce“) lPokud reakce přímo viditelná není, musíme podniknout něco proto, abychom ji „zviditelnili“. Někdy je to velmi složité. Podle toho, jak reakci zviditelníme, existují různé typy těchto metod (například neutralizace, KFR, ELISA, Western blotting, imunofluorescence a podobně) Příklad serologické reakce v praxi lV tomto konkrétním případě by vysrážení přímo vidět nebylo, ale do reakce jsme přidali červené krvinky. Nahoře (pozitivní reakce) se za přítomnosti antigenu i protilátky vysrážely, dole (antigen je přítomen, ale protilátka chybí) nevysrážené krvinky klesly na dno a udělaly „tečku“. TPHA detail Foto: archiv MÚ Průkaz antigenu a antigenní analýza lV rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze tedy dále rozlišit dva podtypy: –Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku –Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) lU nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, jak již bylo uvedeno Serologická laboratoř Obrázek10 Foto: archiv MÚ Nemá protilátky jen proto, že nemoc prodělal kdysi dávno? lPo nákaze protilátky přetrvávají dlouhodobě, někdy celoživotně. Samotný nález protilátek tedy neznamená, že dotyčný je nemocný teď. lPokud to tedy jde, používáme raději přímý průkaz nežli nepřímý. Přesto máme určité možnosti, jak i z nepřímého průkazu zjistit, jestli je ten člověk nemocný teď, nebo jestli byl nemocný kdysi dávno. lPoužívá se například zjišťování množství protilátek, zajímá nás, jestli jich přibývá nebo ubývá, a také určujeme jejich takzvanou třídu (nejvýznamnější jsou tzv. IgM a IgG) Čerstvá, nebo dávno prodělaná nákaza? lPo nákaze přetrvávají protilátky dlouhodobě, někdy celoživotně. Samotný nález protilátek tedy tolik neznamená. Pro rozlišení čerstvé × dávno prodělané nákazy se používá: –zjištění množství protilátek (jako tzv. titru) a změna tohoto množství v čase (dynamika titru; za významnou se považuje čtyřnásobná změna, anebo tzv. serokonverze = v prvním vzorku ještě protilátky nejsou, ve druhém ano) –rozlišení protilátek třídy IgM a IgG (jen u některých novějších reakcí je to ovšem možné) –stanovení tzv. avidity (síly vazby protilátek) Průběh protilátkové odpovědi lAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM lPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) lChronická infekce: různé možnosti IgM a IgG 1 1 2 2 Ukázka jiné serologické reakce (ELISA) ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! Foto: archiv MÚ Nespecifické antigeny a heterofilní protilátky lI v životě se stává, že někdy lze otevřít zámek bez klíče, má-li například zloděj vhodný paklíč. Podobné situace nastávají i v případě reakce antigen-protilátka: lNespecifický antigen (napříkad u tzv. Paul-Bunnellovy reakce k průkazu infekční mononukleózy): protilátky reagují s nějakým jiným antigenem než s antigenem mikroba lHererofilní protilátky: protilátky nejsou namířeny přímo proti mikrobu, ale proti nějaké molekule, která se při infekci tvoří (průkaz takovýchto protilátek se využívá například při diagnostice syfilis) Přehled sérologických metod lPrecipitace (nejstarší a nejjednodušší) lAglutinace (a aglutinace na nosičích) lKomplementfixační reakce (KFR) lNeutralizace (ASLO, HIT, VNT) lReakce se značenými složkami: –Imunofluorescence (IMF) –Radioimunoanalýza (RIA) –Enzymová imunoanalýza (EIA, ELISA) –Imunobloty (= zvláštní případ ELISy) Principy jednotlivých metod lAglutinace a precipitace: komplex Ag – Ig je viditelný. U precipitace se použije samotný Ag, u aglutinace je Ag navázán na částici lKomplementfixace: složitá reakce s využitím jedné složky imunitního systému – komplementu (užívá se morčecí komplement) lNeutralizace: využití přirozené schopnosti protilátek neutralizovat účinek viru či toxinu lReakce se značenými složkami: postupné navazování na povrch, co se neodplaví, zůstane a je detekováno Rozdíl mezi staršími a novějšími metodami lStarší metody (aglutinace, komplementfixace, neutralizace) neumějí rozlišit protilátky třídy IgG a IgM. Proto je tu nutno odebírat dva vzorky séra a sledovat dynamiku titru. Důležité je na žádanku uvést datum prvních příznaků a údaj, zda jde o I. či II. vzorek séra! lNovější metody toto nepotřebují. Titry se nezjišťují, u metody ELISA se zato zjišťují hodnoty absorbance, odpovídající intenzitě reakce (množství molekul, které reagovaly) Příklady interpretace serologických reakcí – 1 lTěhotná pacientka má IgG protilátky proti toxoplasmóze, IgM je negativní lZnamená to, že toxoplasmózu prodělala (možná i bezpříznakově) a teď už není nemocná, ale je chráněná. Je na tom tedy lépe, než kdyby protilátky neměla lPacient má protilátky proti klíšťové encefalitidě v prvním vzorku 1 : 10, ve druhém 1 : 160 lPravděpodobně jeho potíže opravdu způsobil daný virus. Vzestup titru je 16×, to je významné (> 4×) Příklady interpretace serologických reakcí – 2 lIvana má protilátky proti chřipce, v prvním vzorku 1 : 10, ve druhém 1 : 20 lNejspíš je to jen náhoda, Ivana asi chřipku kdysi prodělala, ale nepůjde o akutní stav. Možné je odebrat ještě třetí vzorek lPacient nemá vůbec žádné protilátky proti borelióze, ačkoli potíže odpovídají této nemoci lPacient asi má boreliózu, ale ještě se nestihly vytvořit protilátky. Pokud jsou příznaky typické, je třeba ho léčit, a vzorek séra odebrat znovu. Závěr: Práce laboratoře v praxi Práce laboratoře v praxi lDo laboratoře přijde vzorek lK nepřímému průkazu jsou přijímány vzorky séra (kde hledáme protilátky) lK přímému průkazu jsou přijímány vzorky z těch míst na těle, kde předpokládáme infekci: nejčastější jsou výtěry z krku a nosu, vzorky moče a stolice, ale někdy přijde i třeba kousek srdeční chlopně odebraný při operaci Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!! KLINICKÉ PRACOVIŠTĚ LABORATOŘ Indikace vyšetření – zda, jaké Vlastní provedení odběru Transport materiálu Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu Zaslání výsledku Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Nashledanou příště… Foto: O. Z. P519_03sput_gnty_u2