Principy vyšetření hemostázy, preanalýza FN BRNO Fyziologie krevního srážení Základní homeostatický mechanizmus Spolupůsobení různých systémů včetně regulačních zpětných vazeb ^ Cévní stěny ^ Trombocytů ^ Plazmatické koagulační faktory ^ Plazmatické inhibitory Dělení testů Testy globální postihují celý systém (i více) Testy skupinové (screening) postihují určitou část koagulačního systému ^ umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu Testy speciální ^ vyšetřují jednotlivé složky systémů Dělení testů dle principu -»Koagu lační Fotometrické Imunochemické Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) Sledování času rozpuštění koagula Sledování rozpustnosti koagula Jiné Dělení testů dle principu Koagulační ^ sledování času srážení • manuálně (kývání, rotace) • aktivovaná doba srážení ^ sledování času vytvoření fibrinového vlákna • manuálně (háčkování) koagulometr (poloautomat, automat) mechanické • kuličkové (sledování změn pohybu kuličky) • háčkové optické • nefelometrie (sledování rozptylu světla) • turbidimetrie (sledování průchodnosti světla) Dělení testů dle principu Fotometrické ^ sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A) • end point" (A) • kinetické (AA/min) ^ limitace -hemolytické a ikterické vzorky Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) ^ sledování změn zakalení detekce změn transmise (propustnosti T) • detekce změn absorbance ^ limitace- chylózní vzorky Chromogeny Chromogenní substrát ^ uměle připravený velkoobjemová aminokyselinové koncovka raménko zakončené Argininem bezbarvý paranitroanilid Chromogeny Princip ^ enzymy štěpí substrát - vzniká žluté zbarvení ^ měříme při 405 nm paranitroanilin Kinetické měření čas měření (min) Dělení testů dle principu Imunochemické sledovaní reakce antigénu s protilátkou • aglutinace • LIA • ELISA • EID Aglutinační metody sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu odečítání makroskopicky ^ pozitivní( +, ++, +++)/negativní ^ semikvantitativní metody (udaná mez detekce) metody ^ latexaglutinační (např. FDP, D-Di) ^ hemaglutinační (např. FM) Příklad vyšetření D-Dimerů Mez detekce = 0,5 mg/l neředěný vzorek vzorek ředěný 1:6 výsledek aglutinace < 0,5 mg/l aglutinace + > 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l aglutinace + + > 3,0 mg/l Liquid immunoassay - LIA metody Sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu Odečítání optickým systémem koagulometru Změna zakalení (AA/min) Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...) Limitace ^ Chylozita vzorku ^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem) Princip metody - schéma Reaction buffer Test asm a, 50 ji] Latex suspension 4 m Lnu tea 37&C Mo n i Coro ví ní zrn Ě j i v flbsorbílftCC po dobu 37° C ^ Time (sec.) 60 120 ISO > Odečítání koncentrace sTfR ELISA metody Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní ^ inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab ^ odsátí vzorku + promytí inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag odsátí AbE a promytí ^ detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A) • přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag Elektroimunodifúze - EID metody vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku ■Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu kvantitativní metoda Princip EID kalibrace vzorky pacientů Vyšetření plazmatických proteinů Vyšetření funkční aktivity koagulační metody ^ fotometrické metody Vyšetření antigénu ^ imunochemické metody ^ umožňují odlišení defektů kvalitativních kvantitativních Preanalytické faktory Příprava pacienta Odběr vzorku Transport vzorku Zpracování vzorku Skladování vzorku Příprava pacienta Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru Uvedení léčby Uvedení komplikace při odběru Odběr vzorku Minimální zatažení paže Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek První 2-3 ml nelze použít Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10 Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox) Nedostatečné promíchání krve s citrátem Nebezpečí aktivace a srážení vzorku Koncentrování citrátu u hladiny automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu špatné výsledky ^ ověření po stažení plazmy a promíchání Antikoagulancia Citrát sodný *l 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno * 1,129 mol/l (3,8%) *CTAD zkumavky ^ brání aktivaci trombocytů ^ doporučeno pro testy PAI-1, heparin, Správný odběr vzorku Vyřadit vzorky Sražené S chybným objemem krve (rozdíl 10%) Hemolytické, ikterické a chylózní ^ hemolytický a ikterický vzorek ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení ^ chylózní vzorek ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky Správný odběr vzorku Množství krve (maximálně 2 hod) Méně ^ prodloužení koagulačních časů • APTT citlivé od 90 % objemu • PT citlivé od 80 % objemu Více ^ zkrácení koagulačních časů?? Správný odběr vzorku Hematokrit < 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu 100 - hematokrit ml citrátu = ------------------x ml plné krve 595 - hematokrit Transport vzorku -»Čas (max 2 hod) Teplota (18-25^) Mechanické vlivy (potrubní pošta) Zpracování vzorku Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy Většina testů do 1 -2 hod po odběru * Výjimka EGT, EF (15-30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření fcí trombocytů Vyšetřovaný materiál Plazma plazma bohatá na trombocyty • centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace plazma chudá na trombocyty • centrifugace 15 minut 2500 g bezdestičková plazma dvojnásobná centrifugace (ultracentrifugace) Plná krev Sérum Centrifugace Výpočet otáček pro danou centrifugu g = 1,118x10"5xrxN2 r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad: r = 15 cm, 2500g 3860 otáček/min Skladování primárních vzorků Laboratorní teplota 18 - 25 °C PT 6 hodin APTT 4 hodiny APTT (léčba heparinem) 1 hodinu Ostatní vyšetření: 4 hod Vyšší teplota ne Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne Zamrazování vzorků Plazma chudá na destičky/bezdestičková Objem > 500 ul Zkumavka se zátkou Správná velikost zkumavky Zkumavka naplněná do 3/4 Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C) Skladování zamrazených vzorků a krátkodobé -20 "C, dlouhodobé: - 70 "C Rozmrazování vzorků *Při 37 °C 15 minut Dobře promíchat Opakované zamrazení není možné Analytické faktory Dodržování metodických postupů Správné pracovní návyky Správná funkce a kalibrace přístrojů Výběr diagnostických setů a reagencií Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů Správně provedená kalibrace a kontroly kvality Postanalytické faktory Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků