‹#›
Lékařská mikrobiologie pro ZDRL
Týden 2: Morfologie bakterií, mikroskopie
Upraveno podle MUDr. O. Zahradníčka

‹#›
2
Morfologie a fyziologie, mikroskopie a kultivace
Morfologie bakterií (složení, tvary, uspořádání, sporulace)
Fyziologie bakterií (množení, metabolismus, využívání substrátů)
Mikroskopické pozorování (= pozorování mikroba jako morfologické jednotky)
Kultivace (= pozorování růstových, tedy fyziologických vlastností mikroba

‹#›
3
Morfologie bakteriální buňky
•Z čeho se skládá každá bakterie
•Nepovinné složky bakteriální buňky
•Jaké jsou tvarové možnosti bakterie
•Jaké jsou možnosti uspořádání bakterií
•Zvláštní formy života bakterií – spory

‹#›
4
Z čeho se skládá bakteriální buňka
•Stočený chromozom coby předchůdce jádra
•Ribozomy, nutné k proteosyntéze
•Cytoplasma, prostředí uvnitř buňky
•Cytoplasmatická membrána
•Buněčná stěna
•Vakuoly, buněčné inkluze – dočasná záležitost
•Plasmidy
•Bičíky a fimbrie
•Pouzdro, biofilm

‹#›
5
Buňky Streptococcus pneumoniae
crosssection_streptococcus
www.uni-tuebingen.de

‹#›
6
Chromozom a ribozomy
•Chromozom kruhového tvaru
•Ribozomy jiné než v eukaryotních buňkách
•Bakteriální „jádra“ nejsou viditelná v optickém mikroskopu
•Kromě chromozomu může být genetická informace i v plasmidech (často virového původu)

‹#›
7
Jak může buňka přijít k plasmidu
•Existují v zásadě tři způsoby: transdukce, transformace a konjugace
•Pro různé bakterie je typický ten nebo onen, anebo žádný způsob
•Je to i prakticky významné – plasmidy kódují třeba i rezistenci na antibiotika

‹#›
8
Transdukce

‹#›
9
Transformace

‹#›
10
Konjugace

‹#›
11
Cytoplasma a cytoplasmatická membrána
•Jak v cytoplasmě, tak i na cytoplasmatické membráně probíhá řada chemických procesů
•Na membráně především ty, které využívají rozdílu např. v koncentraci určitých iontů vně a uvnitř
buňky
•Membrána zároveň chrání buňku před chemickými a jinými vlivy

‹#›
12
Buněčná stěna
•Grampozitivní bakterie mají buněčnou stěnu tlustou a jednoduchou
•Gramnegativní bakterie mají buněčnou stěnu tenkou a složitější
•Některé bakterie mají jinou buněčnou stěnu (mykobakteria – acidoresistentní, v buňce jsou mykolové
kyseliny)
•Některé bakterie (mykoplasmata) buněčnou stěnu vůbec nemají

‹#›
13
Základem každé buněčné stěny je peptidoglykan (murein)
peptidoglycan
www.arches.uga.edu

‹#›
14
Grampozitivní buněčná stěna
gm+%20cell%20wall
www.arches.uga.edu

‹#›
15
gm-%20cell%20wall
Gramnegativní buněčná stěna
www.arches.uga.edu

‹#›
16
Fimbrie (pili), curli a bičíky
•Mnohé bakterie jsou schopny pohybu
•K pohybu slouží hlavně bičíky
•Fimbrie mohou vedle pohybu sloužit např. i k adhezi bakterie na povrch, ke konjugaci a podobně
•Curli jsou podobné jako pili, ale zakroucené
•Bičíky bakterií jsou úplně jiné než bičíky eukaryotních organismů

‹#›
17
Bakterie s bičíky (Escherichia coli)
03 escherichia_coli_1
www.biotox.cz

‹#›
18
•
220px-Flagella
Počet a uspořádání bakteriálních bičíků: A. monotricha,
B. lofotricha,
C. amfitricha,
D. peritricha
http://cs.wikipedia.org/wiki/Bi%C4%8D%C3%ADk

‹#›
19
streptococcus_pneumonia050217
Pouzdro a biofilm
•Pouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální
buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání
•Biofilm je souvislá vrstva, vzniklá z bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je
mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě
www.cbc.ca

‹#›
20
Stádia vývoje biofilmu
•Kontakt planktonické bakterie s povrchem            +
•navázání na tento povrch
•adhese, růst a shlukování buněk do mikrokolonií
•produkce polymerické hmoty (matrix, nebuněčná složka)
•Vytvoření trojrozměrné struktury známé jako biofilm
•
•(Převzato z prezentace dr. Černohorské)

‹#›
21
Neobarvené pouzdro
•V barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí pak dobarveno tuší, tuší se pak
pouzdro tam, kde se nic neobarvilo
05 Burri
pathmicro.med.sc.edu

‹#›
22
Sporulace
•Sporulace je něco jako zimní spánek, ale dovedený oproti zimnímu spánku zvířat k mnohem větší
dokonalosti
•Spory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně
•Spora vzniká jako endospora: buňka se rozdělí, ale neoddělí úplně: jedna část se mění ve sporu,
která je zavzata do té druhé buňky
•Nepleťme si spory bakterií a spory hub!

‹#›
23
22 Genre%20Bacillus
membres.lycos.fr

‹#›
24
Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví
21 bacillus
www.cropsoil.uga.edu

‹#›
25
Tvarové možnosti bakterií
•Koky (kulaté, protáhlé, ploché)
•Kokotyčinky
•Tyčinky (rovné, zahnuté, s oblými či špičatými konci, tlusté, tenké)
•Vláknité bakterie (zvláštní případ tyčinek)
•Spirální bakterie – spirochety
•Beztvaré bakterie, např. mykoplasmata

‹#›
26
Zprohýbaná tyčinka – helikobakter
39 helicobacter%20pylori
vietsciences.free.fr

‹#›
27
02a borrelia
Spirochety
11 treponema 53 kansen_02
gemi.mpl.ird.fr
www.primer.ru
www.scidev.net

‹#›
28
39 leptospira
Ještě jednou spirochety
www.med.sc.edu:85

‹#›
29
Možnosti uspořádání bakterií
•Jednotlivě
•Dvojice
•Čtveřice, skupiny po 8
•Shluky
•Řetízky
•U tyčinek: palisády (||||||), řetízky (-----)
diftmik2a
Foto O. Z.

‹#›
30
Tvarové možnosti bakterií
•
classification
http://click4biology.info/c4b/2/cell2.2.htm

‹#›
31
Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.)
06 ECFS
www.morgenwelt.de

‹#›
32
StreptococcusPyogenes
Řetízky v Gramově barvení
mikroby.blox.pl

‹#›
33
Mikroskopie bakterií
•Bakterie jsou dobře viditelné v elektronovém mikroskopu, v praxi se nevyužívá
•V optickém mikroskopu jsou viditelné mizerně. Lépe je vidíme, pokud se pohybují
•Nemůžeme však spoléhat na pohyblivost bakterií. Zviditelníme je proto jinak: fixujeme je a
obarvíme některou z barvících metod

‹#›
34
Práce s mikroskopem
•S mikroskopem zpravidla pracuje mikrobiolog (MUDr., RNDr., Mgr.), avšak i laborant by měl znát
základy mikroskopické techniky, včetně údržby mikroskopu
•Laborant často připravuje mikroskopické preparáty, musí je umět připravit tak, aby byly dobře
viditelné. Nejde jen o samotné barvicí metody, ale i přípravu nátěru (nesmí být příliš řídký,
příliš hustý, při fixaci se nesmí spálit aj.)

‹#›
35
Části mikroskopu – dopadající světlo
•Světlo prochází ze zdroje světla přes kolektor a kondenzor. Kvalitu a množství paprsků ovlivňuje
–intenzita napětí zdroje světla
–irisová clona kolektoru (v dolní části mikroskopu)
–nastavení výšky kondenzoru
–nastavení clony kondenzoru (apertura)
•Výška kondenzoru se obvykle nastaví při zaclonění. V jednom okamžiku okraj clony přestane být
modrý a začne být červený – to je ten správný moment. Pak se clona zase rozevře.

‹#›
36
Zvětšovací optika
•V mikrobiologii používáme zpravidla binokulární mikroskop s vyjímatelnými okuláry zvětšujícími 10×
•Objektivy se používají 4×, 10×, 20×, 40×, 60× a imerzní objektiv zvětšující 100×. „Imerzní“
znamená, že mezi preparát a objektiv se kápne imerzní olej. Index lomu oleje je bližší indexu lomu
skla, než index lomu vzduchu

‹#›
37
Zaostřování a vlastní mikroskopie
•Aniž bychom se dívali do okuláru, přiblížíme makrošroubem preparát k objektivu na co nejtěsnější
vzdálenost
•Nyní, již pod kontrolou zraku preparát opatrně oddalujeme, nejdříve makrošroubem, pak i
mikrošroubem, až se dostaneme na příslušnou hladinu ostrosti
•V některých případech (hlavně u nativních preparátů) není jedna hladina ostrosti, ale je nutno
stále přeostřovat na „dno“ a „hladinu“ prostoru vyplněného tekutinou

‹#›
38
Čištění mikroskopu
•Po každém použití imerzního oleje je nutno očistit objektiv gázou s alkoholéterem (méně vhodný,
leč použitelný, je benzín)
•Občas je nutno očistit i neimerzní objektivy, zejména pokud jsou potřísněny např. olejem
•Při potřísnění je také nutno otřít mikroskopický stolek, zde stačí čtvereček buničité vaty s
benzínem. Nečistota často ulpívá pod zařízením pro uchycení sklíčka

‹#›
39
Jednoduché barvení
•K jednoduchému barvení můžeme použít kde co, například methylenovou modř
•V laboratorní praxi se zpravidla nepoužívá, můžeme ho však doporučit např. při telefonické
konzultaci vzdálenému klinickému pracovišti
•Fixovaný preparát se přelije jedním barvivem, a po zaschnutí se pozoruje

‹#›
40
Pohádka (teda, ono to má i reálný základ J)
•Byl jednou jeden Dán, a ten se jmenoval Christian Gram. Barvil si bakterie a byl naštvaný. Občas
nabarvil vzorek od pacienta, jenže kromě bakterií si obarvil i epitelie, a to se mu nelíbilo.
„Hnusné epitelie, zakrývají mi bakterie!“, nadával.
•A tak začal bádat. Hledal nějaký postup, při kterém by bakterie zůstaly nabarvené, ale epitelie by
barevné nebyly…
•Pokračování na další obrazovce

‹#›
41
Pokračování pohádky
•Přišel na to, že když vzorek obarví krystalovou nebo genciánovou violetí, a pak vazbu barviva na
buněčnou stěnu posílí Lugolovým roztokem, neodbarví se bakterie ani alkoholem. Zato epitelie se
odbarví. „Hurá“, zakřičel, když to zjistil.
•Jenže záhy zjistil, že s epiteliemi se mu odbarví i část bakterií. „Do pr…kýnka“, zabručel, vypil
zbytek alkoholu, co měl na odbarvování, a svou práci mrštil do kouta…

‹#›
42
A pohádka končí…
•O nějakých dvacet let později jistý mladý badatel našel v koutě jedné badatelny zaprášenou práci
pana Christiana Grama.
•Jak si to tak pročítal, pokyvoval hlavou a říkal si –hm, nebylo to špatné, jen to chtělo něco
přidat.
•A tak na závěr procesu Gramova barvení přidal dobarvení safraninem (nebo Gabbetem čili
karbolfuchsinem). Sice obarvil na červeno nejen odbarvené bakterie, ale i epitelie, ale to mu vůbec
nevadilo. Vždyť o přítomnosti epitelií ve vzorku může být užitečné vědět!
•A tak vzniklo Gramovo barvení v dnešní podobě.

‹#›
43
Prof. Hans Christian Gram
Hans_Christian_Gram
Hans Christian Joachim Gram (13. září 1853 – 14. listopadu 1938) byl dánský bakteriolog. Gram
studoval botaniku na Kodaňské Univerzitě a byl botanickým asistentem zoologa Japeta Steenstrupa. V
roce 1878 začal studovat medicínu a promoval 1883. V roce 1884 v Berlíně vyvinul metodu,  která
dnes slouží k.rozlišení dvou hlavních tříd bakterií. V.roce 1891 se Gram stal přednášejícím
farmakologie, a v témže roce byl jmenován profesorem Kodaňské univerzitě. V roce 1900 převzal
vedení farmakologického ústavu.
en.wikipedia.org/wiki/Hans_Christian_Gram.

‹#›
44
Gramovo barvení – princip 1
•Grampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu.
–Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť…
–…a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem…
–…se neodbarví ani alkoholem.
•Gramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem.

‹#›
45
Gramovo barvení – princip 2
Chemikálie
Grampozitivní
Gramnegativní
Krystal. violeť
Obarví se fialově
Obarví se fialově
Lugolův roztok
Vazba se upevní
Upevní se méně
Alkohol
Neodbarví se
Odbarví se
Safranin
Zůstanou fialové
Obarví se červeně
Gramem se nebarvící bakterie se neobarví v prvním kroku kvůli absenci buněčné stěny (Mycoplasma)
nebo proto, že jejich stěna je vysoce hydrofobní (Mycobacterium).
Spirochety by se barvily gramnegativně, ale jsou velmi tenké, takže i je lze také vlastně považovat
za „Gramem se nebarvící“ a Gram se v jejich diagnostice nepoužívá.

‹#›
46
Vsuvka: Lugolův roztok je směs I2 a KI
•Jean Guillaume Auguste Lugol (18. 8. 1786 – 16. 9. 1851) byl francouzský lékař. Narodil se
v Montaubanu. Studoval medicínu v Paříži a promoval v roce 1812. Roku 1819 se stal ordinářem
v Nemocnici svatého Ludvíka, kde působil až do důchodu. Zajímal se o tuberkulózu a měl přednášku na
Královské akademii věd v Paříži, kde se zastával čistého vzduchu, cvičení, studených koupelí a
léků. Publikoval čtyři knihy o tuberkulózním onemocnění a jeho léčbě (1829, 1830, 1831, 1834).
Navrhl, že by se jeho jódový roztok mohl používat k léčbě tuberkulózy. To tehdy vzbudilo velkou
pozornost. I když se Lugolův roztok k léčbě TBC nehodil, byl zato Plummerem s úspěchem použit k
léčbě thyreotoxikózy.
•
•http://en.wikipedia.org/wiki/Jean_Guillaume_Auguste_Lugol
lugol
www.jergym.hiedu.cz

‹#›
47
P1010003 Detektiv a mikroskop
Foto O. Z.

‹#›
48
Čtyři hlavní skupiny bakterií podle Gramova barvení
•
950fb8bfd9ef455198a2d61c04565f85 b_subtilis
http://faculty.mc3.edu/jearl/ML/b_subtilis.jpg
gramnegative_rods
http://www.billwilcox.net/1011/Ch27prokaryotes/gramnegative_rods.jpg
mosloen1
http://www.asm.org/division/c/photo/mosloen1.JPG
grampozitivní
koky
tyčinky
gramnegativní

‹#›
49
Směs G+ a G- bakterií
mixed%20gram
www.arches.uga.edu

‹#›
50
P1010001
Foto O. Z.

‹#›
51
Další barvicí metody
•Barvení podle Giemsy – spíše na parazity
•Barvení dle Ziehl-Neelsena na acidorezistentní bakteria
•Barvení pouzder dle Burriho
•Barvení fluorescenčními barvivy

‹#›
52
10 treponema0
Fluorescenční barvení
www.primer.ru

‹#›
53
Speciální mikroskopické techniky
•Mikroskopie v zástinu – používá se u světlolomných objektů (např. spirochet). Na objekt dopadají
paprsky zešikma a do oka dopadnou POUZE ty, které se na něm zlomí
–Anglicky se jí říká „darkfield microscopy“ – mikroskopie v temném poli. Pozadí je tmavé, bakterie
světlá
•Mikroskopie ve fázovém kontrastu využívá fázový posun paprsku

‹#›
54
Zástinová mikroskopie
Zástin

‹#›
55
09 Listeria
Nashledanou
•Příště budeme pokračovat povídáním o fyziologii bakterií a kultivačních půdách
•
microbewiki.kenyon.edu