Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 11: Neutralizační reakce, reakce se značenými složkami Ondřej Zahradníček Co nás dnes čeká nBudeme pokračovat v diagnostice, založené na interakci antigenu (v.případě mikrobiálních antigenů jde o povrchovou část těla mikroba) s.protilátkou (imunoglobulinem, který je tvořen makroorganismem. nPřitom můžeme prokazovat zvířecí protilátkou antigen (přímý průkaz) nebo antigenem protilátku v séru (nepřímý průkaz) Průkaz antigenu a antigenní analýza (pro připomenutí) nV rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy: nPřímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku nAntigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) nU nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky A ještě trochu opakování: Interpretace nPrůkaz antigenu (včetně antigenní analýzy) je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta nPrůkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: nMnožství protilátek (titr) a hlavně jeho změna nTřída protilátek: IgM/IgG nAvidita protilátek – síla vazby na antigen Jak tyto informace zjistit nČerstvá infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně i IgA nPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) IgM a IgG 1 1 2 2 Titry •Titr – nejvyšší ředění, kde je pozitivní reakce. •Máme-li dvě řady, je titrem nejvyšší ředění z obou řad dohromady. •Při použití geometrické řady znamená •vzestup/pokles titru o jeden důlek dvojnásobný vzestup pokles. •vzestup/pokles o n důlků je pak vzestup/pokles 2nnásobný. Vzestupy a poklesy titru Proč nestačí samotný titr nNěkdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v.akutní fázi titr dosti nízký Dva pacienti Velmi reaktivní pacient má naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký Párová a nepárová séra nPárová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý. Pak jsou oba hodnoceny naráz. Čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Bohužel párová séra nejsou běžná. nSéra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup titru. Tyto údaje jsou však pouze orientační a liší se případ od případu. Pořád musíte mít na paměti: nVeškeré „srandičky“ typu titry, třídy protilátek, zjišťování avidity, slouží k.odlišení akutní infekce, chronické infekce a stavu po dávno prodělané infekci. Týkají se ovšem pouze nepřímého průkazu! nPřímý průkaz totiž přímo prokazuje v těle pacienta část patogenova organismu. Není tedy nutné žádné další upřesnění Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Průkaz antigenu Antigenní analýza Nepřímý průkaz Aglutinace občas často někdy Precipitace málokdy málokdy občas KFR často (viry) ne často (viry) Neutralizace občas ne často Značené složky velmi často výjimečně velmi často Neutralizace nKlasické, ale stále používané reakce nNapodobují přirozenou funkci protilátek (protilátky blokují cytopatický či „erytrocytopatický“ efekt viru či toxinu) nHodí se jen u některých infekcí (virové infekce, infekce toxickými bakteriemi) nPrincip je jednodušší než u KFR Neutralizační reakce: obecný princip nProtilátky fungují několika způsoby. Jeden z nich je přímá neutralizace. nTento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů nNicméně někdy protilátky neutralizují i určitou charakteristiku celé bakterie, např. pohyblivost Treponema pallidum u tzv. Nelsonova testu (TPIT). Neutralizace schématicky nProtilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Červená Karkulka bez protilátky.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Červená Karkulka s protilátkou.bmp Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Toxin či virus Toxin či virus Protilátka + – Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Příklady neutralizačních reakcí Úkol Neutralizován Objekt Reakce 1 Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO 2 Virus Erytrocyt shlukování HIT 3 Virus Buňka efekt metabolický VNT Příklad 1: ASLO nProtilátka (ANTISTREPTOLYZIN O) blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. nASLO není nepřímý průkaz, přestože hledáme protilátky. Nepátráme tu po patogenovi, určujeme samotné protilátky, jež mohou být nebezpečné nU ASLO neužíváme geometrickou řadu. Hodnoty ředění jsou speciální. nTitr nad cca 200 znamená možnost autoimunitní odpovědi Proč se dělá ASLO nPomocí testu ASLO zjistíme, zda je přítomna normální protilátková odpověď, nebo přemrštěná automimunita s rizikem vývoje glomerulonefritidy nebo revmatické horečky nTest ASLO se provádí zpravidla po prodělané streptokokové infekci. Průkazem protilátky se nesnažíme prokázat infekci (o té víme), ale zjistit, zda dochází k vývoji autoimunity. Je to tedy zvláštní případ, kdy vlastně nejde o nepřímý průkaz infekce, přestože prokazujeme protilátky. ASLO: princip ASLO Hodnocení ASLO nPanel se odečítá naležato. První řádek prvního panelu je pozitivní kontrola, dále má každý pacient jeden řádek nNejvyšší ředění se zábranou hemolýzy (pozitivní reakce, projeví se sedimentací erytrocytů) je titr nTitry cca 225–270 jsou hraniční, vyšší jsou pozitivní, nižší jsou negativní. Úplná absence protilátek znamená, že se pacient se streptokokovou infekcí nesetkal Jamka č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hodnota m. j. 100 120 150 180 220 270 337 405 506 607 759 911 Ukázka výsledku ASLO nPozitivní kontrola je pozitivní (337 jednotek). Kdyby měl takovou hodnotu pacient, bylo by u něj velké riziko pozdních následků infekce. D:\Atlas (F)\atlas\serology\aso\aso.jpg 2006-04-07 10 ASLOu Pacienti 1, 3, 6 a 7 se setkali se streptokokovou infekcí, ale hodnota ASLO 120 jednotek je nízká, pozdní následky jim zřejmě nehrozí. Příklad 2: HIT nHemaglutinačně Inhibiční Test nPozor, tohle NENÍ aglutinace, je to druh neutralizace! nProtilátka neutralizuje virové shlukování krvinek (in vitro vlastnost většiny virů) nPozitivní reakce = zábrana virového shluknutí à erytrocyty klesají na dno důlku nNegativní reakce = viry se shluknou nVypadá to jako hemaglutinace naruby Zapamatujte si: nHIT není aglutinace, ale neutralizace virového shlukování krvinek nHIT se liší od reakce ASLO především tím, že krvinky nejsou hemolyzovány, ale shlukovány. Stejné je naopak to, že specifická protilátka dokáže příslušnému efektu zabránit nHIT v našem příkladu je „už zase“ klasický nepřímý průkaz (na rozdíl od ASLO) n HIT – vyhodnocení výsledků nHIT se hodnotí v mikrotitrační destičce podobně jako např. KFR či ASLO nTitr je poslední důlek, ve kterém je ještě tečka (nedošlo ke shluknutí krvinek a ty sedimentovaly na dno) nJe to tedy úplně naopak než třeba u TPHA: tečka tu znamená pozitivitu, „chuchvalec“ negativitu Příklad 3: VNT (nepleťte si to s TNT J ) nVirus Neutralizační Test nViry lze pěstovat na buněčných kulturách. Jsou to buněčné linie většinou embryonálních či nádorových buněk nBuněčná kultura bývá poškozena účinkem virů. Škodu můžeme pozorovat např. jako nzměnu morfologie buněk v kultuře nzměnu metabolismu à změna pH à změna zbarvení v důlku (při použití indikátoru) nJsou-li přítomny protilátky, mohou tomuto vlivu na buňky zabránit Ukázka vyhodnocení VNT nV pravém sloupci jsou různé kontroly, jinak žluté důlky ukazují pozitivitu a červené negativitu. V prvním dvojřádku máme pacienta se stálým, nízkým titrem. V dalším dvojřádku je pacient, jehož titr se čtyřikrát zvýšil. Další pacient se s infekcí nikdy nesetkal. Poslední dvojřádek ukazuje pacienta se sérokonverzí. D:\Atlas (F)\atlas\serology\colortest\colortest.jpg Průběh protilátkové odpovědi – opakování nProtilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce nProtilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou IgM a IgG (novorozenec je tedy může mít od matky) Protilátky ostatních tříd nProtilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) nProtilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi nS protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje Reakce se značenými složkami nNa povrch se postupně navazují jednotlivé složky nMísto jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje nJe-li to pravda, složka se naváže nPokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec nNa konci řetězce je vhodné značidlo Promytí a jeho význam nPokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní nProto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch nJe-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení Příklad pozitivního a negativního průběhu Laboratorní protilátka Hledaný antigen Antigen chybí Značená laboratorní protilátka (àdetekce) Značená laboratorní protilátka + – Není navázaná je odplavena nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii) Pacientův vzorek Laboratorní protilátka Typy značidel nFluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence nRadioizotop je značidlem u reakce RIA nEnzym je značidlem u reakce ELISA nWestern blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny nPoužíváme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc. C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\07 22b.jpg www.biologie.uni-hamburg.de Imunofluorescence Imunofluorescence C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\08 immunofluorescence.jpg C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\09 immuno4.jpg C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\10 ifakit.jpg www.amsbio.com www.kcl.ac.uk www.bindingsite.com Imunofluorescence nPřímá imunofluorescence n(Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) nNepřímá imunofluorescence n(Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) n IF_TP Výhoda: Povrchem je tu podložní sklíčko. To nám umožňuje vidět tvar mikroorganismů. Imunofluorescence schematicky C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Plocha\IMF 1 a 2.bmp A: Treponema pallidum – od pacienta B: Značená protilátka proti Treponema pallidum C: Treponema pallidum – z laboratoře D: Protilátka proti Treponema pallidum – od pacienta E: Značená protilátka proti lidské protilátce C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\05 elisa_1.jpg ELISA www.genprice.com ELISA C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\02 pathscan_elisa.jpg www.cellsignal.com C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\04 ELISA.jpg virology-online.com ELISA – proč je tak oblíbená nU reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. nNenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím nMožnost automatizace je velkou výhodou oproti imunofluorescenci ELISA – praktické provedení nZpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry nPřed vlastními důlky pacientů mohou být důlky: nBl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) nK- a K+ – pozitivní a negativní kontrola nCut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) nVždy záleží na konkrétní reakci ELISA a jejím provedení. Někdy chybí blank, někdy není cut off přímo obsažen v.destičce, ale počítá se jako průměr negativních kontrol + konstanta. ELISA – ukázka (www.medmicro.info) ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! Western blotting nNázev – slovní hříčka (badatel Southern) nPrakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty nJe tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů Western blotting – princip n1: původní antigen (směs) n2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem n3: elektroforetické rozdělení antigenů n4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu n5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Western blotting.bmp Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Western blot. Klikni! Možnosti uspořádání složek bleděmodře vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta nPovrch-antigen-protilátka-značidlo (P) nPovrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) nPovrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) nPovrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) nKonjugát je protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu nKonjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) nJe to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG nDokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky nPoužití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek ELISA k detekci protilátky: 1. Pozitivní (hledá se IgM, IgM přítomna) nVšechny složky se postupně navazují. Dojde k.enzymatické reakci – změně barvy v důlku C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 0A.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 1B.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 1C.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 1D.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 1E.bmp ELISA k detekci protilátky: 2. Negativní I (hledá se IgM, žádné protilátky) nV séru pacienta nejsou protilátky. Konjugát je odplaven, v důlku není žádná změna. C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 0A.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2B.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2C.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2D.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2E.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2F.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2G.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 2H.bmp ELISA k detekci protilátky: 3. Negativní II (hledá se IgM, přítomny IgG) nV séru pacienta jsou jen IgG protilátky. Konjugát je odplaven, ke změně barvy důlku nedojde C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 0A.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3B.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3C.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3D.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3E.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3F.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3G.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Elisa 3H.bmp ELISA, průkaz antigenu nU reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá nIntenzitu zbarvení lze měřit spektrofotometricky nZa pozitivní se považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ nNapříklad se u konkrétní se cut off může počítat třeba jako n(A1 + B1 + C1)/3 + 0,050 ELISA, průkaz protilátek nU nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM a IgG nV daném případě se místo IgA používá IgM nZa pozitivní se opět považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ nTakže se například použije vzorec n(B1 + C1)/2 + 0,320 v případě IgA, resp. (B3 + C3)/2 + 0,320 v případě IgG nVýsledky mezi 90 % a 110 % cut off se často hodnotí jako „hraniční“, pod 90 % jako „negativní“, nad 110 % jako „pozitivní“ Imunochromatografické testy nImunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent podobně jako předchozí nDůležitým rozdílem je, že zde není promytí. Některé komponenty jsou navázány na povrch na určitých místech (testovací a kontrolní místo), další se hned naváží na testovanou složku a spolu s ní cestují porézní vrstvou. V pozitivním případě je zpravidla pozorován proužek u testu i u kontroly, v negativním jen u kontroly. Příklad principu imunochromatografického testu H:\Prezentace\immuno_ge.gif http://www.bl-inc.jp/images/immuno_ge.gif Princip (jen jedna z možností) + – Testovací oblast Kontrolní oblast Imunochromatografické testy: výhody nJsou velmi rychlé (desítky minut) nJsou velmi jednoduché à některé se nedělají v laboratoři, ale přímo u pacienta nJsou dostatečně přesné? nMohou být použity pro mnoho účelů (včetně mimomikrobiologických, například těhotenský test) nNevýhoda: jsou poměrně drahé ve srovnání s tradičními testy Přeji Vám hezký zbytek dne… (Obraz s názvem Protilátka) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Z internetu\Labouši\T08 imunita\05 antibody.jpg www.twitchfilm.net/archives/ 003401.html