Parametry metod automatické fotometrické analýzy Každá metoda prováděná automatickým biochemickým analyzátorem má v softwaru řídícího počítače nadefinované parametry: • číslo (aplikační kód) metody • název metody • biologický materiál (sérum, plazma, moč…) • typ měření změn absorbance (end-point, kinetické měření) • délka inkubace – doba trvání reakce ( do 10 min) • měřící body reakce • vlnová délka • objem pipetovaného vzorku, • objem pipetovaných reagencií (R1, R2, R3…) • podmínky při opakování analýzy s menším, stejným nebo větším objemem vzorku • způsob/typ kalibrace • parametry pro zajištění validní kalibrace (limity pro citlivost a opakovatelnost) • pracovní rozsah metody a další parametry k ověření integrity výsledku (absorbanční limit, limit pro kontrolu linearity průběhu reakce) Parametry metod automatické analýzy Parametry definují analytickou metodu. Zadávají se do automatických analyzátorů takto: •Manuální vkládání jednotlivých parametrů (ustupuje, možnost chyby) •Kompletní aplikace od výrobce – instalace z diskety, cd nebo přes web, možnost úpravy pouze u některých parametrů Popis významných parametrů Vlnové délky, bichromatické měření: Všechny testy pro klinickou chemii jsou v současné době měřeny simultánně při dvou vlnových délkách – hlavní a vedlejší. Bichromatické měření Koncentrace se počítá z rozdílu absorbance obou měření. Výhodné, neboť kompenzuje: •variace světelné emise fotometru •citlivost fotodiod •bublinky nebo částečky v cestě světla Hlavní vlnová délka je dána absorpčním maximem reakce Vedlejší vlnová délka je zvolena tak, aby •rozdíl absorbancí mezi hlavní a vedlejší λ byl co největší •současně se při ní musí minimálně uplatňovat interference •současně má být co nejblíže k hlavní λ Na analyzátorech bývá běžně možnost využívat pro různé metody 12 vlnových délek Měřící body reakce: •Absorbance reakčních roztoků v kyvetě je periodicky měřena po každém cyklu přístroje (kolem 20s) během reakčního času (3 – 10 minut) •Přístroje jsou schopny přidávat vzorky a činidla v určité fázi reakčního času dle typu prováděného měření •Přesná specifikace měřícím bodem Typy měření: End point – jednobodové (měří se absorbance na konci reakce) End point - dvojbodové (blank + konec reakce) End point - tříbodové (např. pro ISE) Kinetické (rate) – měří se změna absorbance za časovou jednotku Při reakci dochází k nárůstu (stanovení CK) či poklesu absorbance (stanovení ALT, AST) Způsoby kalibrace: Automatické analyzátory umožňují např. tyto typy kalibrace: •Lineární dvoubodovou – pro fotometrické metody •Nelineární Logit-log 3P •Nelineární Logit-log 4P •Nelineární Logit-log 5P – pro turbidim. a imunoturb.m. •Nelineární exponenciální •Nelineární Spline Ověření integrity výsledku: •Aby se zabránilo vydání nesprávného výsledku při extrémní koncentraci, analyzátory automaticky provádí zkoušky na ověření správnosti výsledku •Není-li výsledek po technické stránce v pořádku, je označen chybovým hlášením a ve většině případů automaticky naředěn •Používají se následující zkoušky: test na linearitu, test na dodržení absorbančního limitu, test na kontrolu vyčerpání substrátu, test detekující Hook efekt Test na linearitu •Je prováděn automaticky u všech kinetických metod •Linearita je kontrolována pomocí lineární regresní analýzy. Není-li splněna, vzorek je označen chybovým hlášením (př. Lin.) Test na dodržení absorbančního limitu •Naměřená absorbance vzorku je tak vysoká, že nelze zajistit spolehlivé výsledky •U vzorků se objeví chybové hlášení a musí se ředit •Integrita výsledku je zajištěna nastavením absorbančního limitu Test na kontrolu vyčerpání substrátu •Uplatňuje se absorpční limit i kontrola linearity •Není-li reakce lineární, do výpočtu jsou zahrnuty pouze body z lineární oblasti Test detekující Hook efekt -při nadbytku antigenu u imunoturbidimetrických stanovení (Prozone Check) -koncentrace antigenu je tak vysoká, že dochází k rozpouštění precipitátu Test detekující Hook efekt •Objevuje se u imunoturbidimetrických stanovení •Koncentrace ve vzorku vysoká •Leží na pravé straně Heidelbergovy křivky •Chybně stanovená nízká koncentrace měřením absorbance je s využitím Prozone Check detekována a označena chybovým hlášením •Stanovení je pak znovu provedeno z menšího objemu nebo z naředěného vzorku •Prozone Check je nejčastěji proveden následovně: Po skončení reakce se stoupající směrnicí absorbance je přidán další definovaný objem antigenu. Absorbance je měřena před i po přidání antigenu (viz 1-Point Assay) Technický limit – výsledky, které leží mimo technický limit jsou označeny chybovým hlášením a nesmí být vydány dokud nejsou zopakovány - nejčastěji po naředění Repeat limit – výsledky jsou technicky správně, jsou pouze mimo limit zvolený laboratoří pro opakování Možnost korekce na nespecifické výsledky •Existuje možnost vložit korekční faktory – např. pro kreatinin, kdy se u Jaffého metody projevuje vliv reakce proteinů Sérové indexy •Stupeň potenciální interference způsobené bilirubinem, hemoglobinem nebo lipémií lze stanovit - tzv. sérové indexy •Test je založen na měření naředěných vzorků při různých vlnových délkách Sérové indexy