Automatické imunochemické analyzátory Petr Breinek Logo MU Automatické imunochemické analyzátory •Automatizace koncem 80. let •Uplatnění pro analyty s nízkou koncentrací (nmol/l, pmol/l) •Využití reakce antigen – protilátka •Jedná se o uzavřené systémy – pouze pro reagencie výrobce přístroje •Značená protilátka (případně antigen) •Většinou heterogenní imunoanalýza (pevný povrch – paramagnetické částice, kulička) •Doba analýzy 15 – 60 min •Detekce s vysokou citlivostí (luminiscence) • • • Automatické imunochemické analyzátory •Principy se liší typem značky, separace a detekce •Jsou opatřeny čtečkou čárového kódu, umožňují tak jednoznačnou identifikace pacienta •Zpracovávají vzorky v primární zkumavce •Požadavky pro jednotlivé analýzy jsou přijímány z LIS •Cena vyšetření poměrně vysoká - řádově mezi 50 – 200 Kč • • • • • Cobas e411 üPlně automatizovaný analyzátor pro heterogenní imunoanalýzu založený na technologii elektrochemiluminiscence (ECL) ü88 výsledků/h, inkubace 9 – 18 – 27 min ü75 vzorků na 15 stojáncích, STAT pozice üReagenční disk: 18 různých metod, 2-D čárový kód üProgramovatelných 60 metod üStabilita reagencií: 7-12 týdnů üDvoubodová kalibrace, individuální a kumulativní QC üSpotřeba vody: 12ml/test ü ECL •Elektrochemiluminiscence - proces při kterém luminofory reagují na povrchu elektrody a produkují světlo • •Protilátka (příp. antigen) je označena rutenium(II) tris-bipyridylovým komplexem • •K elektrochemiluminiscenci dochází po vložení napětí na elektrodu a reakci s tripropylaminem (TPA) Modular E170 üAnalyzátor pro heterogenní imunoanalýzu založený na technologii elektrochemiluminiscence (ECL), který je součástí modulárního analytického systému • Cobas® 6000 a 8000 üPlně automatizovaný modulární analytický systém, používající 3 měřící principy (ISE, fotometrii a elektrochemiluminiscenci) üISE jednotka: 90 nebo 1800 testů/h üFotometrický modul: až 2000 testů/h üImunoanalýza: 170 testů/h 20100907_c8000c701c502e602e602 8 Roche Modular (Roche) Roche Modular a imuno 9 AutoMate 2550 (Beckman Coulter) Sample Processing System Architect i 2000 SR, Abbott sejmout0016 Architekt i 2000 SR – detail distribučního systému sejmout0014 ARCHITECT i2000/i2000SR •25 metod, chlazený karusel •Velikost reagenčních souprav 100 a 500 testů •Automatické opakované testování, ředění a reflexe •Detekce kapalin, detekce sraženin •Použití čárových kódů •Možnost integrace s biochemickým analyzátorem ARCHITECT c8000 •Výkon systému je až 200 testů za 1 hodinu (400 pro i4000, 600 pro i6000 a 800 pro i8000) • • Architekt i 2000 SR - detekce •Technologie ChemiFlex CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na paramagnetických mikročásticích) -měření vyzařovaných chemiluminiscenčních emisí v reakční nádobce • •Stručný postup: • 1. Změření pozadí po přídavku peroxidu vodíku • 2. Dávkování NaOH (Trigger) do reakční nádobky • 3. Zachycení emitovaného světla a jeho odvedení světlovodem do fotonásobiče •Značení patentovaným akridiniem • • 14 14 Architect 16200 (Abbott) principy měření Fotometrie • Měření v koncovém bodě (End-point) • Měření reakční rychlosti (Kinetické metody) • Turbidimetrie 33 fotometrických bodů 16 vlnových délek (340 až 804nm) Potenciometrie Technologie integrovaných čipů (ICT) Abs fotometrie.jpg Potenciometrie.jpg CMIA Chemiluminiscenční imunoanalýza na paramagnetických mikročásticích f Chemiflex™patentovaný ester akridinu •oxidace v kyselém prostředí • změna prostředí na zásadité • vzniká nestabilní N-metylakridon • při přechodu do stabilní formy se uvolní energie v podobě světla Axsym • •80-120 testů/ hod •Měřící principy: • MEIA • FPIA • REA a ICIA •Robustnost, •Dotyková obrazovka •Doba analýzy 15 - 20 min •Ukončen prodej image: AxSYM / AxSYM Plus 5.0 Axsym •MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay) •Enzymová imunoanalýza na mikročásticích • •Vzorek se smíchá s reagenciemi, pak se inkubuje •Separace na skleněných vláknech matrice •Přídavek konjugátu s alkalickou fosfatázou •Přídavek substrátu – 4-methylumbelliferylfosfát (MUP) •Hydrolýza MUP s ALP •Fluorescence methylumnelliferonu • Axsym (Abbott) •FPIA – Fluorescenční polarizační imunoanalýza • •Polarizační fluorescenční záření emitováno z indikátoru, kterým je značený analyt •Hodnota polarizace emitované fluorescence je úměrná rychlosti rotace molekuly •Rotace je úměrná velikosti molekuly – malé analyty rotují rychleji než komplexy •Měří se změna v polarizaci emitované fluorescence po vytvoření komplexu analyt-protilátka UniCell DxI 800 üImunochemický systém üMarker (ALP) üParamagnetické mikročástice üLuminiscenční detekce přeměna dioxetanfosfátu na dioxetan Substrát: Lumi-Phos 530® ü200 testů/h (1) 400 testů/h (2) üDoplňováním reagencií za provozu üÚdržba: 5 min/d üKompatibilta s biochemickými analyzátory a s preanalytickou linkou ü Immage üPoměrová nefelometrie a turbidimetrie v blízké infračervené oblasti (NIPIA) üStanovení proteinů a léčiv ü72 vzorků ü24 reagencií ü180 analýz/h ü Advia Centaur (Siemens) centaur • •Pracuje po pacientech při využití principu "RANDOM ACCESS„ - analýzy se provádějí v optimálním časovém rytmu •Stroj se nemusí zastavovat pro doplnění reagencií a vzorků • Advia Centaur (Siemens) centaur • üplně automatizovaný analyzátor s chemiluminiscenční detekcí pro rutinní i statimová vyšetření ü240 stanovení/h, první výsledek je po 15 min, dále každých 15 s üPrincip měření: chemiluminiscenční reakce, pevná fáze jsou paramagnetické částice (Fe2O3), magnetická separace, značka je AE (acridinium ester), emituje světlo při oxidaci H2O2v alkalickém prostředí üChlazený zásobník s 30 pozicemi ü ü ü • üDoplnění reagencií, špiček, destilované vody, kyvet, vylití odpadu, odstranění použitých špiček či kyvet za chodu Advia Centaur (Siemens) • 1 chlazený zásobník reagencií •2 3 reagenční jehly •3 inkubační kotouč s kyvetami •4 luminometr •5 jehla pro dávkování NaOH •6 odsávací jehla pro odpad •7 dodávání kyvet •8 promývací jehly •9 magnety •10 promývání •11 jehla pro dávkování H2O2 •12 jehla pro dávkování pomocných roztoků •13 vzorková jehla •14 chlazený zásobník pomocných reagencií •15 zásobník špiček •16 prostor pro aktuálně dávkované vzorky •17 vstup pro vzorky •18 stojánek pro vzorky •19 vstup pro statim •20 výstup hotového vzorku •21 softwarové ovládání analyzátoru • popis2 Advia Centaur (Siemens) • Vzorek je vložen do stojánku a ten je dán do vstupu pro vzorky. Stisknutím tlačítka START je stojánek posunován v řadě a vsunut do dávkovacího prostoru . Vzorková jehla nabere ze zásobníku pro špičky jednu špičku, nabere vzorek ze zkumavky a nadávkuje jej do kyvety v inkubačním kruhu. Ten je vyhříván na 37oC a neustále se otáčí, čímž umožňuje takt zpracování 15 sekund. Kyveta se vzorkem se otočí k jehle, která event. dávkuje pomocný roztok dále ke 3 reagenčním jehlám, které nezávisle dávkují primární reagencie z primárních zásobníků. Kyveta se poté otočí k promývacím jehlám a promývací stanici. Magnetické částice jsou pomocí magnetů přichyceny na stěnu kyvety, promývací jehly odsají tekutinu z kyvety a magnetické částice jsou promyty destilovanou vodou, která je opět odsáta. Inkubační kruh posune kyvetu k jehle, která dávkuje peroxid vodíku a poté k výtahu, který dopraví kyvetu do luminometru. Ten má 3 části: fotonásobič, jehlu, která dávkuje NaOH a jehlu, která odsává vše do odpadu. Po přidání NaOH, proběhne chemiluminiscenční reakce. • Luminometr měří emitované světlo v relativních světelných kvantech a ta převádí na výsledky / koncentrace. • popis2 Immulite 2000/2500 üPrincip: chemiluminiscence Ke konjugátu vázanému na reakční kuličce a značenému alkalickou fosfatázou (ALP) je přidán substrát (adamantyl dioxetan fosfát). Účinkem ALP dojde k odštěpení fosfátu a ze substrátu vzniká nestabilní anion, při jehož rozkladu dojde k emisi fotonů ü200 testů/h ü24 reagencií (chlazené) üInkubace 35 nebo 70min üDetekce sraženin ü ü ü ü Immulite 2000 - Chemická reakce substrátu Kryptor Brahms üTechnologie TRACE (časově rozlišená zesílená fluorescence) üHomogenní imunoanalýza (odpadají promývací a separační kroky) üMěření statimových vzorků üPřipojení k LIS Kryptor (Brahms) •Princip měření: •Neradioaktivní přenos energie z donoru (kryptátová struktura s iontem europia v centru) na akceptor (chem. modif. protein) •Měření signálu emitovaného z imunokomplexu s časovým zpožděním •Měřený vzorek je ozářen dusíkovým laserem, následně donor (kryptát) emituje fluorescenční signál, po něm emituje signál akceptor Berthold Lumat LB 9507 Berthold Autolumat LB 953 Tosoh Bioscience AIA 900 a 2000 Princip: FEIA (enzymová imunoanalýza s fluorescenční detekcí) Výkon: 200 testů/h Vzorky: 170 + STAT pozice Reagencie: 48 metod (960 testů) Reakční čas: 10 nebo 40 min Detekce sraženiny, automatické ředění, QC program, … Pathfast Imunochemický analyzátor pro stanovení kardiálních markerů (NT-proBNP, Myoglobin, Troponin I, CK-MB, D-dimery, ß-hCG, CRP, Presepsin) üPrincip: chemiluminiscence se separací pomocí magnetických částic üZ jednoho vzorku lze změřit až 6 parametrů üVýkon: 18 testů/h üPrvní výsledek:po 17min üPočet vzorků: 6 Pathfast RAD 120, Radim •Patentovaná technologie nazvaná “Pegasus” • Pevná fáze - železitan potažený zirkoniem •Částice se silnou vazebnou kapacitou k biologicky aktivním molekulám •Rychlá a efektivní separace •Fluorescenční detekce při 450 nm ~8808604 RAD 120, Radim - charakteristika •Kontinuální přidávání reagencií a vzorků za chodu •Primarní, sekundarní vzorky, pediatrické kyvety •Výkon: až 120 testů/hod •Reflexní testování •Kalibrace – stabilní až 4 týdny •Archív pacientů •Dotyková obrazovka • • VIVA-E (Siemens) Systém na testování drog s technologií EMIT Princip:VIVA – E üTechnologie Emit® II - homogenní enzymatická imunoanalytická technika üVýsledek: do 10 min üVýkon: do 65 testů/h(se 3 reagenciemi), do 130 testů/h (se 2 reagenciemi) üKapacita: 51 vzorků üReagencie: 12 metod EMIT v přístroji • •Test založen na kompetici mezi látkou ve vzorku a látkou značenou enzymem glukoso-6-fosfát dehydrogenázou (G6PDH) o vazebná místa na protilátce •Aktivita enzymu klesá při vazbě na protilátku, proto lze koncentraci látky ve vzorku měřit podle změny aktivity enzymu •Aktivní enzym mění nikotinamidadenindinukleotid (NAD) na NADH --} změna absorbance (spektrofotometricky) •Endogenní sérová G6PDH neinterferuje, koenzym NAD působí pouze s bakteriálním enzymem (Leuconostoc mesenteroides) použitým v testu Princip EMIT (1) Homogenní enzymatická imunoanalytická technika Test založen na kompetici mezi látkou ve vzorku a látkou značenou enzymem glukoso-6-fosfát dehydrogenázou (G6PDH) o vazebná místa na protilátce Lék značený aktivním enzymem Vazbou protilátky na značený antigen dochází k inaktivaci enzymu Protilátka Komplex s inaktivovaným enzymem Princip EMIT (2) Homogenní enzymatická imunoanalytická technika Po přidání vzorku obsahujícím stanovovaný lék dochází k soutěži léku s lékem značeným enzymem o vazebná místa na protilátce. Lék značený aktivním enzymem + stanovovaný lék Čím větší je koncentrace stanovovaného léku ve vzorku, tím větší je stanovovaná aktivita enzymu Protilátka Stanovovaný lék soutěží o protilátku, výsledkem je to, že enzym zůstává částečně aktivní •Aktivní enzym mění nikotinamidadenindinukleotid (NAD) na NADH --} změna absorbance (spektrofotometricky) • •Endogenní sérová G6PDH neinterferuje, koenzym NAD působí pouze s bakteriálním enzymem (Leuconostoc mesenteroides) použitým v testu Dimension Vista 1500 Intelligent Lab Systém - Siemens •Integrovaný systém - (klin. chem., ISE, imuno) •Technologie LOCI - založena na přenosu kyslíku • •První homogenní imunoanalýza s chemiluminiscenční detekcí – novinka • •Vysoká citlivost • /siemens/en_GLOBAL/gg_diag_FBAs/images/product_images/Dimension_Vista/DimensionVista1500_wBarcode_v 2_ca6.jpg VIDAS® a miniVIDAS® üPrincip: ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) üVýkon: do 100 testů/2h, STAT pozice, 12 vzorků současně üminiVIDAS je kompaktní verzí systému VIDAS (PC, tiskárna, klávesnice) evidence Evidence, Randox • Biočipová array technologie • Imunoanalýza založena na simultánní multianalýze • Na biočipu panel příbuzných testů • Princip ELISA Elisys Quattro - HUMAN •Plně automatický ELISA analyzátor středního výkonu Elisys Quattro (HUMAN) Více než 40 ELISA testů Až 7 desek naráz 4 nezávislé inkubátory Čtečka čárového kódu zkumavek Automatická kontrola množství reagencií ELISA reader a promývačka (washer) Závěr üAutomatizace heterogenní imunoanalýzy = možnost dostupného a rychlého stanovení celé řady analytů (tumorové markery, kardiomarkery, hormony, léky, vitaminy,…) •Ale: üProblémy se standardizací → s pravdivostí → se srovnatelnosti výsledků → s EHK,… ü •Specifita protilátek, interference, závislost na analytickém systému, … • •