Optické metody Denzitometrie Vertikální fotometrie Reflexní fotometrie Denzitometrie lOptická metoda, která se zabývá měřením optické hustoty l lpřímá denzitometrie – v procházejícím světle přes průhledný nosič Denzitometr lPřístroj, který slouží k vyhodnocení optické hustoty zbarvení v plošném uspořádání. Jedná se o postup, který je podobný fotometrickému stanovení (liší se v uspořádání), zaznamenává měnící se hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení lZdroj světelného záření: halogenová žárovka lMonochromátor: interferenční filtry lDetektor: fotonásobič Přímá denzitometrie lPrincip: lměření intenzity záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam fotometrovaného úseku. lJednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky zvonovitého tvaru. Plocha těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi. l lPoužití: při hodnocení lelektroforeogramů l Denzitometr lElektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky lV místě frakcí dochází k částečné absorpci záření – to se projeví při dopadu na detektor lPo zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí lNa jedné podložce je součastně vyhodnocováno až 30 elektroforetických drah Elektroforeogram – elektroforéza v plošném uspořádání na agaróze Elektroforéza bílkovin v agarózovém gelu lDělí bílkoviny krevního séra na 5 (6) frakcí: lFrakce albuminu: tvořena jedinou bílkovinou lFrakce globulinové: lΑ1-globuliny: α1 lipoprotein, orosomukoid,α1antitrypsyn lΑ2-globuliny: α2 makroglobulin, ceruloplasmin, haptoglobin, pre-β lipoprotein lΒ1-globuliny:transferin, fibrinogen, C3, β – lipoprotein lB2-globuliny: C3 lgama-globuliny: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE http://www.sebia.fr/image_v2/courbe/puce/70_gb.gif Elektroforetické typy lNa základě charakteru rozdělení frakcí v elektroforéze - vymizení frakcí, objevení se nových frakcí, nebo jiný vzájemný poměr frakcí, lze usuzovat z určitého elektroforetického typu na určité skupiny chorob. (stavů) ELFO typ Elektroforetická frakce Albumin Globuliny a1 a2 b1 b2 g 1. Typ akutního zánětu Ô ÓÓ ÓÓ N (Ó) N 2. Typ chronického zánětu Ô Ó Ó N N ÓÓ*) 3. Typ chronické hepatopatie Ô Ô Ô Ô Ô Ó 4. Typ nefrotického syndromu ÔÔ N ÓÓ ÓÓ ÓÓ Ô 5. Typ malnutrice ÔÔÔ (Ó) N (Ó) N (Ô) N N 6. Typ monoklonální gamapatie Ô Kdekoli úzký proužek monoklonálního imunoglobulinu; g-frakce může zcela vymizet Monoklonální gamapatie l lNižší koncentrace albuminu. Někde (tj. kdekoli) mezi a1- až g-globuliny se nachází úzký proužek monoklonálního imunoglobulinu. lNádorové onemocnění mnohočetný myelom. Waldenströmova makroglobulinémie, hemoblastózy, karcinom, plazmocytom aj. S věkem výskyt paraproteinů roste, ve stáří se i u zdravých lidí objevují benigní monoklonální imunoglobuliny, a to bez klinických příznaků onemocnění Vzácnější nálezy l lBisalbuminémie (zdvojení frakce albuminu), analbuminémie (chybí frakce albuminu), deficit a1-antitrypsinu (chybí a1-frakce), atransferinémie (pokles b1-globulinů), hypogamaglobulinémie (dědičný či získaný defekt syntézy imunoglobulinů); hemolytické sérum (projevy: posun a2-globulinů ke katodě, zvýšení b2-globulinů), fibrinogen (proužek mezi b- a g-globuliny), zvýšení b-lipoproteinů (LDL; intenzivní proužek v b-oblasti) HYDRASYS Zařízení pro elektroforézu: poloautomat HYDRASYS (fy SEBIA) HYRYS 2 Denzitometr HYRYS (fy SEBIA) Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 038 http://www.sebia.fr/image_v2/courbe/puce/70_gb.gif Význam denzitometrie lKvantitativní vyhodnocení jednotlivých frakcí získaných elektroforetickým dělením bílkovin v biologickém materiálu lVedle grafického výstupu (křivka elektroforeogramu) , vypočítává software denzitogranu procentuální zastoupení jednotlivých bílkovinných frakcí l Význam v diagnostice MG lELFO bílkovin s následnou denzitometrií má klíčový význam pro diagnózu MG l MG: jsou definovány jako skupina onemocnění, které jsou charakterizovány proliferací jednoho klonu plazmatických buněk produkujících homogenní imunoglobulin. Toto onemocnění má maligní nebo potenciálně maligní charakter Význam v diagnostice MG l V elektroforeogramu pátráme vizuálně po atypické zóně. V séru mohou mIg migrovat v širokém rozsahu od oblasti a2-globulinů až po katodický konec zóny gama-globulinů. l Normální rozsah migrace polyklonálního IgG je celá katodická část počínaje zónou b1, IgM – migruje v anodické zóne gama, IgA – migruje v iterzóně b1 a b2- globulinů. l Metodou volby pro identifikaci mIg v séru a moči je elektroforéza s vyšší rozlišovací schopností. (HR) l Vertikální fotometrie Vertikální fotometrie lSpektrofotometrická metoda,s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru l Využití : proměření absorbance v jamkách mikrotitračních destiček, které se používají hlavně pro imunochemická stanovení na principu ELISA (analýzy s navázaným enzymem za využití imunosorbce) ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assays lPrincip: lReakce antigenu (analytu) s protilátkou. Protilátka, nebo antigen je určitým způsobem označen. lPři ELISA stanovení se ke značení protilátky (antigenu) používají enzymy (alkalická fosfatáza, peroxidáza, b-galaktozidáza), které po přidání substrátu do reakční směsi katalyzují reakci, na jejímž konci je barevná látka vhodná k fotometrické detekci. ELISA techniky podle typu reakce antigen –protilátka l l lKompetitivní heterogenní imunoanalýza l lNekompetitivní heterogenní imunoanalýza (sendvičová) ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce 1.protilátka je pevně vázána na stěnu jamky mikrotitrační destičky 2. 2. přidání stanovovaného vzorku a značeného antigenu 1 2 ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce l3. inkubace: kdy o vazebné místo na protilátce soutěží značený antigen a neznačený antigen (analyt) ze vzorku l4. promývání: přebytek nenavázaného antigenu (značeného i neznačeného – tzv. volná frakce), který nezreagoval, se vymyje pomocí promývacího roztoku l 3 4 ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce l6. přidání substrátu l l l l l7. Měření intenzity barevného zbarvení vytvořeného barevného produktu Spektrofotometrická detekce barevného produktu 6 7 ELISA - Kompetitivní heterogenní reakce lPlatí zde nepřímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu (neznačeného antigenu), tím nižší intenzita zbarvení (tím méně navázaného značeného antigenu). lKompetitivní ELISA metodu lze použít i ke stanovení protilátek: l na povrchu jamky mikrotitrační destičky je ukotven antigen a v tomto případě soutěží neznačené protilátky z analyzovaného vzorku se značenými protilátkami (z reagencie, o známé koncentraci) o vazbu na antigenu l opět zde platí nepřímá úměra ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce 1.první protilátka je navázana v nadbytku na stěně jamky mikrotitrační destičky l l2. přidání vzorku (antigenu) l l3.první inkubace: vytvoření imunokomplexu (antigen – 1. protilátka) 1 2 3 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce l4.promývání: z reakční směsi promytím odstraní nenavázaná frakce l l l5. přidá se druhá protilátka: značená enzymen (tzv. konjugát), která je namířena proti druhé antigenní determinantě na stejném antigenu l 4 5 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce l l6. druhá inkubace: je vytvořen „sendvičový“ komplex l l l l7. druhé promytí: dojde k separaci nadbytečného nenavázaného konjugátu 6 7 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce l l8. přidání substrátu l l l l l9. měření: změření intenzity zbarvení vytvořeného barevného produktu Spektrofotometrická detekce barevného produktu 8 9 ELISA - Nekompetitivní (sendvičová) heterogenní reakce l lnejvíce používaná ELISA metoda lplatí zde přímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu, tím vyšší intenzita zbarvení. Využití ELISA metod lELISA metody lze použít pro stanovení nízkomolekulárních látek, jako jsou : l proteiny, l karbohydráty, l nukleové kyseliny, l lipidy aj. lStanovení se provádí různých typech biologického materiálu.. Využití ELISA metod lNejčastěji jsou analyzovány vzorky: l séra, plazmy, l moče, l mozkomíšního moku, l tkáně nebo lyzáty buněk. l lELISA metody mají široké uplatnění ve zdravotnických laboratořích hlavně v imunologii a mikrobiologii (méně v biochemii nebo hematologii), kde se používají pro stanovení např. infekčních agens nebo protilátek. l Využití ELISA metod lVýhody: ljsou citlivé a specifické lmají nízké pořizovací náklady na technickou instrumentaci. lNevýhody: lanalýza vzorků pouze v sériích, lčasová náročnost (doba jedné inkubace je více než 30 min., obvykle 1-2 hod. ) lmanuální pipetování lVzorky nelze ředit během analyzované série. ELISA - Technická instrumentace lProvádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. l l l lKaždá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8 jamkách. l ELISA - Technická instrumentace lMikrotitrační destičky vyžadují při promývání: l použití speciálních osmikanálových pipet l automatických ELISA promývaček. lPokud to metoda vyžaduje, lze během inkubace mikrotitrační destičku umístit do třepačky s možností nastavení intenzity třepání a inkubační teploty. l ELISA - Technická instrumentace l lPro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček: je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru. ELISA reader (vertikální spektrofotometr) lPrincip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové délky) do optických kabelů, lkteré zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů: 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. lDevátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje (obrázek č.8). l Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se posune a může se měřit řada následující. ELISA reader (vertikální spektrofotometr) l Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 017 ELISA reader (vertikální spektrofotometr) lSoučásti vertikálního fotometru: lzdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. lInterferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle se používá 6 filtrů (pro λ 400-800 nm). lOptický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační destičky). lDetektor: používají se fotodiody. lRychlost měření je 5s (celá mikrotitrační destička - 96 ljamek). Vertikální fotometrie lVztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6-ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce. Vertikální fotometrie lPři ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. lPoté software přístroje sestrojí kalibrační křivku (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y,hodnoty koncentrace na ose x), ze které odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků l Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků. ELISA automatická linka lAutomatická linka provádí: l automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a kontrol pomocí pipetovacího systému (2, 4, 8 jehel). lMá zabudovanou čtečku čárového kódu, což umožňuje pozitivní identifikaci pacientských vzorků. lLinka má obvykle 3-4 místa pro umístění mikrotitračních destiček. lDále sestává z inkubátoru (místo pro inkubaci vzorků), l promývačky a readeru mikrotitračních destiček. lTransport destiček mezi jednotlivými částmi provádí pomocí robotického ramene. S lsystém provádí automatické ředění vzorků a je opatřen softwarem pro automatické vyhodnocení měření. ELISA automatická linka lVelkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím zabránění záměny mezi vzorky. Dále je to přesnost pipetování vzorků a reagencií, vysoká kapacita přístroje. lNevýhodou je vyšší spotřeba používaných reagencií. l Reflexní fotometrie Reflexní fotometrie lPrincip lměření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy lPoužití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná fáze slouží jako nosič obsahující činidla aktivovaná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném biologické materiálu (krev, moč). lMěří se intenzita záření odraženého od homogenně zbarvené podložky.(matrice) Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) lČinidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována vlákna proužku (fy Roche, Reflekton) l lČinidla jsou nanesena v reagenční zóně proužku jako vícevrstevný film (fy Kodak) l Reflexní fotometr lOdraz světla od reagenční zóny: lzrcadlový – na reflexní ploše zrcadla ldifuzní - je výsledkem interakce dopadajícího světla s molekulami reakční zóny (zahrnuje i absorpci a rozptyl) l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lZdroj záření: lhalogenová lampa l xenonová výbojka lsvětloemitující dioda l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lUlbrichtova koule (jako zdroj difuzního lsvětla): ldutá koule jejíž vnitřní povrch je potažen vysoce reflexním materiálem (síran barnatý). lSvětlo ze zdroje se po vstupu do koule mnohonásobně odráží od stěn a jako dokonale difuzní dopadá na reagenční plošku Hlavní komponenty reflexního fotometru lDetektor záření: luvnitř koule jsou umístěny dva detektory. lJeden měří světlo difuzně odražené od reagenční plošky a druhý je referenční l refl_fotometr urisys2400_new Reflexní fotometr pro chemické vyšetření moče pomocí diagnostických proužků Děkuji za pozornost