Suchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot) * Kapka kapilární krve nanesena na testovací kartičku filtračního papíru a vysušena –odběr z prstu –ušního lalůčku –z patičky (u novorozenců) – –odběrová kartička ze speciálního filtračního papíru (např. Whatman 903, Schleicher & Schuell…) s definovanými vlastnostmi – – * vyražení terčíku ze suché krevní kapky –nejlépe ze středu skvrny * vyextrahování krve z terčíku vhodným rozpouštědlem nebo pufrem * použití extraktu k analýze 2_viii_spec_valid dry blood spot [USEMAP] Provedení odběru kapky na screeningovou kartičku –odběr z prstu, ušního lalůčku nebo v případě novorozenců z patičky –drobná incize v místě odběru (dobře prokrveném, očištěném alkoholem a suchém) –první kapka krve setřena suchým sterilním tamponem –další kapka nasáta do screeningové kartičky tak, aby filtrační papír byl viditelně nasáklý z obou stran –nutno zabránit příměsi tkáňového moku, kontaminaci papírku i skvrny, vrstvení více kapek –sušení skvrn v horizontální poloze kartičky při pokojové teplotě –překrytí suché kapky krycím papírkem (součást kartičky), vyplnění údajů pacienta, odeslání do laboratoře patička1 patička2 patička3 patička5 odběr Suchá krevní skvrna • +++ * méně invazivní, odběr malého objemu (10 až 100 μl) - šetrnější k pacientovi, vhodná zvláště pro odběry novorozenců * po usušení skvrny - stabilní (inaktivace enzymů ve vzorku, analyty jsou pouze po krátkou dobu v roztoku) - vzorky není třeba mrazit * lze je snadno dlouhodobě uchovávat při laboratorní teplotě a některá stanovení provádět z archivovaných vzorků i po letech (DNA) * snadná a bezpečná manipulace se vzorky, nízké riziko práce s infekčním materiálem (možno přepravovat poštou) • --- * malé množství materiálu - pro analýzu nutné velmi citlivé metody: MS-MS, DELFIA, polymerázová řetězová reakce při analýze DNA * časově náročnější zpracování ve srovnání s analýzou kapalného materiálu díky nutnosti vyrážení terčíku a jeho extrakci - neumožňuje plnou automatizaci celého procesu * hodnoty získané analýzou krevní plazmy a krevní skvrny nemusí být zcela srovnatelné v důsledku odlišné matrice vzorku (matematické korekce, které se snaží vliv odlišné matrice eliminovat, nemusí vždy přinášet vyhovující výsledky) * příměsi z filtračního papíru * nehomogenita krevní skvrny Využití techniky suché krevní skvrny: * novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu a endokrinních onemocnění * stanovení hormonů, lipidů, glykovaného hemoglobinu,… * stanovení léků a jejich metabolitů (farmaceutický průmysl - farmakokinetické a toxikokinetické preklinické studie) – technika LC/MS/MS * mikrobiologie, serologie (epidemiologické studie, vyhledávání HIV-pozitivních pacientů, hepatitida, cytomegalovirové infekce…) * molekulárně genetická vyšetření mutací * • –Technika suché krevní skvrny - ideálním řešením pro zavedení celoplošného novorozeneckého screeningu a v této oblasti naprosto nezastupitelná Novorozenecký screening * aktivní a celoplošné (=celostátní) vyhledávání novorozenců se zvýšeným rizikem některých vzácných onemocnění * umožní u novorozenců provést včasnou diagnostiku v období, kdy klinické příznaky ještě nejsou zjevné, a zajistit tak včasnou léčbu dříve, než onemocnění způsobí nevratné poškození * odběr proveden za definovaných podmínek všem novorozencům ve věku 48-72 hodin po narození * stanovení koncentrace látek specifických pro vyhledávané choroby, eventuelně i průkaz genové mutace • • •Informační webový portál o NS: http://www.novorozeneckyscreening.cz/index.php 2_i_nozicka Historie * 1963 - poprvé použita metoda suché krevní skvrny pro screening metabolických poruch ve velkých populacích novorozenců - prof. Guthrie (USA) • * Guthrieho bakteriální inhibiční analýza: –jednoduchá, levná a spolehlivá metoda pro novorozenecký screening fenylketonurie • - dědičná porucha metabolismu fenylalaninu - patologické hromadění fenylalaninu v krvi a ostatních tělních tekutinách - hyperfenylalaninémie poškozuje CNS dítěte, vede k těžké oligofrenii • §Metoda založená na stimulačním efektu aminokyseliny fenylalaninu na růst bakterie Bacillus subtilis: •umístění terčíku suché krevní skvrny na agar obsahující bakteriální spóry •inkubace při 37°C •hodnocení průměrů růstových zón - jsou úměrné koncentraci fenylalaninu ve vzorku guthrie Guthrie Novorozenecký screening * S vývojem citlivých analytických technik (DELFIA, tandemová hmotnostní spektrometrie) se rozšiřuje počet onemocnění, které lze diagnostikovat ze suché krevní skvrny • - spektrum vyšetřovaných metod se v různých zemích liší, záleží na incidenci choroby v dané populaci a na ekonomických podmínkách • * Novorozenecký screening v ČR • • 1975 – celoplošný novorozenecký screening fenylketonurie • od 2009 – 13 chorob • - kongenitální hypotyreóza - vrozená snížená funkce štítné žlázy • - kongenitální adrenální hyperplazie - vrozená nedostatečnost tvorby • hormonů nadledvin • - cystická fibróza - vrozená porucha tvorby hlenu dýchacích cest • - 10 různých dědičných poruch metabolismu aminokyselin (př. • fenylketonurie) a mastných kyselin