Lucie Říhová
OKH, FN Brno
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE
Princip a využití
Průtokový cytometr
 flow cytometrie (flow+cyto+metrie)
 specializovanější varianta fluorescenčního
mikroskopu v kombinaci s krevním analyzátorem
 měření fyzikálních, chemických a biologických
vlastností až 106 buněk v suspenzi
Cytomics FC500 (Beckman Coulter)FACSCantoII (Becton-Dickinson)
Složení průtokového cytometru
1. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace
fluorescence navázaných barev
2. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku
a usměrňování jeho toku
3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků
dle l pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory
4. Elektronika a počítačový systém - převod optického
signálu na elektronický a další zpracování
Složení průtokového cytometru
1. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace
fluorescence navázaných barev
2. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku
a usměrňování jeho toku
3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků
dle l pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory
4. Elektronika a počítačový systém - převod optického
signálu na elektronický a další zpracování
detektory
fluorescencí
FS detektor
SS detektor
optické filtry
nosná
kapalina
buněčná
suspenze
polopropustná
zrcadla
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html
Světlo vs. buňka
Forward Scatter
- rozptyl světla v malém úhlu
- velikost buňky
Side Scatter
- rozptyl světla pod úhlem 90°
- komplexita buňky
Fluorescence
- přítomnost fluorochromu
detektor
detektor
detektor
Fluorochromy
excitace UV/violet diode (fialový laser) - 405 nm
- DAPI, Hoechst/Pacific Blue (452), AmCyan (491), BD Horizon 450 a 500
excitace Ar-iontovým laserem (modrý) - 488 nm
FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm)
Alexa Fluor 488 (519 nm)
PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm)
ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm)
PerCP - perridin chlorophyl (678 nm)
PerCPCy5.5 - tandem. konjugát PerCP-Cy5.5 (696 nm)
PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm)
PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm)
PI - propidium jodid, široký peak okolo 620 nm
excitace He-Ne laserem/red diode (červený) - 633 nm
APC - allophycocyanin (670 nm)
APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm)
Analýza a zobrazení
leukocytární gate
monocytární gate
lymfocytární gate
debris
FS lin
SS lin
FS - forward scatter - velikost buněk
SS - side scatter - granularita/komplexita
A
B
C
1-parametrová analýza
Histogram
 osa x - intenzita fluorescence, osa y – počet buněk
 hodnocení - odečet % pozitivních buněk
 neg. peak = autofluorescence, izotypová kontrola
 poz. peak - různá intenzita exprese
low (+/-) < dim (+) < high, bright (++) < very high (+++)
 porovnávání intenzity exprese
Intenzita fluorescence (lineární nb logaritmická stupnice)
početbuněk
2-parametrová analýza
FITC
PE
I. kvadrant – FITC-PE+
II. kvadrant – FITC+PE+
III. kvadrant – FITC-PEIV.
kvadrant – FITC+PEI.
II.
III. IV.
Dot plot
 dva parametry proti sobě - FLx vs. FLy, FLx vs. FS či SS
 procentuální hodnocení - nejčastěji kvadrantová analýza
Sortování subpopulací
Bezprostředně po analýze
dochází piezoelektricky k
„trhání“ proudu vzorku na
kapky - obsahující jednu
buňku - přičemž požadovaným
buňkám = kapkám
je udílen el. náboj.
Tyto jsou pak v el. poli
vychylovány
a odseparovány.
udělení náboje
a separace
gateovaných bb
Stanovení povrchových a intracelulárních markerů
exprimovaných jednotlivými hodnocenými buňkami
 vznik CD klasifikace v r. 1982, využívá k identifikaci
buněk tzv. CD markerů - Cluster of Differenciation,
def. cca 300 znaků (antigenů Ag) a není uzavřeno
 historicky označeny nejprve leukocytární markery,
později zahrnutí dalších znaků (megakaryocyty,
trombocyty, erytrocyty…)
 různá fce - buněčné enzymy, receptory mikrobiálních
Ag, transportní proteiny, prezentace Ag, Fc receptory,
komplementové receptory, regulační signalizační
receptory a jejich ligandy, adhezivní proteiny…
Imunofenotypizace - CD znaky
Hematopoeza
Identifikace subpopulací
 pomocí MoAb proti znakům přítomným na povrchu
nebo v cytoplazmě buňky
 na základě exprese CD markerů rozlišení subpopulací
buněk, jejich stádia vývoje a zralosti, patologie…
T lymfocyty CD1a - CD3, CD4, CD5 - CD8...
B lymfocyty CD19, CD20 - CD24, CD79 - CD84...
NK buňky CD16, CD55, CD56, CD57, CD244...
kmenové buňky CD34, CD117...
trombocyty CD36, CD41, CD42a, CD42b, CD61...
erytrocyty Gly-A (CD235a)...
leukocyty CD45...
monocyty CD14...
dendritické bb CD83, HLA-DR, ILT3...
Princip IFT
monoklonální protilátka (MoAb) konjugovaná
s fluorochromem (fluorescenční molekulou)
suspenze buněk s určitými povrchovými
či intracelulárními antigeny (Ag)
vizualizace specifické vazby MoAb-Ag
možnost kombinace několika MoAb
 vizualizace mnoha znaků najednou
Anti CD3-FITC
Anti CD19-PE
+
plná krev
kostní dřeň
bb suspenze
vybrané protilátky
konjugované
s fluorescenční
barvou
+
=
označení buněk
vazbou protilátek
na odpovídající Ag
=
T
T
B
B
Vazba MoAb - Ag
Zpracování a analýza vzorku
Imunofenotypizace
 typ vzorku - buněčná suspenze - nesrážlivá periferní
krev či kostní dřeň (EDTA, Heparin), BAL, kultivované
buňky, desintegrovaná lymfatická uzlina…
 Inkubace - se specifickou monoklonální protilátkou
proti požadovaným znakům (T, B, NK buňky…)
 lyzace erytrocytů - pokud jsou obsaženy v suspenzi
osmoticky, enzymaticky či chemicky
 fixace - 0,5% paraformaldehydem
 proplach - vymytí nadbytečné protilátky pomocí PBS
 analýza - získání listmode a vyhodnocení histogramů
Klinické využití FC
 Rutinní vyšetření a výzkumné analýzy
 imunologie
 hemato-onkologie
 transplantologie
 transfuziologie
 hematologie
Imunologie
Analýza imunokompetentních buněk (IFT)
 subpopulace T, B, NK buněk
 dif. dg. imunodeficiencí apod.
Analýza autoprotilátek
 proti leukocytům, erytrocytům či trombocytům
Analýza funkce neutrofilů
 oxidativní vzplanutí
 fagocytóza
Základní populace lymfocytů
T lymfocyty
- cytotoxické: CD3+CD8+
- pomocné: CD3+CD4+
B lymfocyty
- B2: CD19+CD20+
- B1: CD5+CD19+CD20dim+
NK buňky
- CD3-CD16+CD56+
- NK-T: CD3+CD56+
CD8-FITC/CD4-PE/CD45-PC5/CD3-PC7
CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PC5/CD19-PC7
CD45+ lymfocyty
CD45+ lymfocyty CD45+ lymfocyty
CD45+ lymfocyty
Absolutní počty buněk
Využití firemního roztoku s přesně definovaným počtem
částic na ml a fluorescencí ve všech kanálech
 zadáván jako kalibrátor
 shodný objem vzorku a kalibrátoru
HIV+ pacienti - stanovení abs. počtu CD4+ helper T lymfocytů
558 bb/ul1135 bb/ul 11 bb/ul
CD45+ lymfocyty CD45+ lymfocytyCD45+ lymfocyty
Transplantologie
Zjištění zastoupení hematopoetických kmenových buněk
 CD34+ leukocyty (hematopoietic stem cell, HSC)
 v rámci transplantace kmenových buněk
 monitorování PK po stimulaci G-CSF, v transplantátu…
 analýza pupečníkové krve…
Vymezení leukocytů Označení mrtvých bb Vymezení CD45+
leukocytů
Označení CD34+ HSC
Hemato-(onkologie)
 Analýza povrchových a intracelulárních
markerů - imunofenotypizace
 dif. dg. leukémií, lymfomů apod.
 analýza stavu onemocnění (remise, relaps…)
 stanovení minimální reziduální nemoci
 DNA analýza
 ploidita a proliferace buněk
 Analýza apoptózy a nekrózy…
Diferenciální diagnostika
hematologických malignit
Vychází ze znalostí exprese povrchových
a intracelulárních molekul v průběhu diferenciace
krevních bb
 přítomnost patologických buněk s odlišným fenotypem
 liniová příslušnost (lymfoidní, myeloidní, monocytární aj.)
 diferenciační stupeň hematologických malignit
 analýza smíšeného fenotypu u leukémií
 detekce aberantně exprimovaných markerů
Kdy provádět IFT?
 cytopenie (zejména bicytopenie a pancytopenie)
 leukocytózy (lymfocytózy, monocytózy a eozinofilie)
 nález atypických buněk či blastů v PK, KD či jiných TT
 zvýšený počet plazmocytů, monoklonální gamapatie
 organomegalie či nález tkáňové masy
neutrofilie ze zralých buněk
polyklonální hypergamaglobulinémie
polycytémie, trombózy a bazofílie
Akutní myeloidní leukémie
Klonální neoplastická proliferace myeloidních blastů
 Antigeny prekurzorových buněk: CD34, CD38, CD117, HLA-DR, TdT
 Myeloidní antigeny: CD13, CD15, CD33, CD65, MPO
 Antigeny monocytární diferenciace: CD14, CD4, CD64,
CD36, CD11b, CD11c
leukocyty leukocyty
Lymfoproliferace - B-CLL
Patologické B1 (CD5+CD19+) lymfocyty přítomny v PK
- vesměs charakteristický fenotyp CD20dim+CD23+
- bez exprese povrchových kappa/lambda lehkých řetězců Ig
CD5+CD19+ CD20dim+ sk-/sl-
CD23dim+
Malignity z PC
 plazmocyty (PC) fyziologicky přítomny v nízkém
zastoupení - produkce vlastních MoAb
 zvratem v diferenciaci vznikají maligní PC
- prekanceróza - MGUS (nízký počet maligních PC)
- kumulace maligních PC v KD - mnohočetný myelom
 charakteristický fenotyp
 rozlišení fyziologických CD19+ a patologických CD56+ PC
 myeloma stem cells - CD138-CD34-CD27+
 vysoký stupeň proliferace
 schopné diferenciace do maligních CD138+bb
Analýza PC u MG
normální
CD19+CD56-PC
abnormální
CD19-CD56+PC
CD38+CD138+ PC
Nejčastější aplikace u PLT I.
 Diagnostika dědičných či získaných defektů
 Glanzmanova trombocytopenie (GPIIb/IIIa - CD41/CD61)
 Syndrom Bernard Soulier (GPIb/IX - CD42b/CD42a)
 Syndrom šedých destiček (P-selektin - CD62P)….
 Aktivace PLT in vivo
 analýza na aktivaci závislých Ag (CD62P)
 analýza PLT-PLT agregátů, případně agregátů s Leu
(CD62P iniciuje interakci s PSGL-1 na leukocytech)
 destičkové mikropartikule
Defekty PLT GP
Glanzmanova trombastenie
Krvácivý stav
CD61 CD41
CD36
Nejčastější aplikace u PLT II.
 Transfuziologie
 monitorování koncentrátů PLT
(zbytkové WBC, aktivace PLT - ↑ CD62P, ↓ CD42b)
 detekce s PLT asociovaných Ig
(potransfuzní reakce, ITP)
 Analýza PLT obratu
 detekce retikulovaných PLT
(kvantifikace nezralých destiček - stupeň trombopoezy)
 počty PLT
Hereditární sférocytóza
 nejčastější vrozená hemolytická anémie
 molekulární defekty membránových proteinů
erytrocytů (spectrin, band 3…)
 narušený bikonkávní tvar
 destrukce ve slezině
 diagnostické testy
 sférocyty, osmotická rezistence, autohemolýza
 kryohemolýza
 průtoková cytometrie
vazba kyseliny eosin maleimidové (EMA) na erytrocyty
- analýza snížení fluorescence oproti kontrole
Hereditární sférocytóza
MFI - medián intenzity fluorescence EMA = poloha peaku na ose X
MFI P/MFI K= EMA ratio ~ 1 u pacientů bez HS a <0,9 u HS
K - kontrolní vzorek
P - pacient s HS
K - kontrolní vzorek
P - pacient s HS po
transfuzi ERY
EMA ratio
= 33,6/46,8 = 0,72 EMA ratio
= 43,3/42,4 = 1,02
zbytkové patologické
erytrocyty na pozadí
transfundovaných
PNH - Paroxysmální noční
hemoglobinurie
Chybění glykofosfatidyl-inositol proteinové kotvy
 Analýza CD235a+ erytrocytů
▫ dle zastoupení CD55-/CD59- buněk různé typy PNH I-III
 Analýza monocytů a neutrofilů - CD45+ a CD14+/CD33+
▫ přítomnost proaerolyzinu FLAER - protilátka proti GPI
Ery CD235a+ Ery CD59- Ery CD55- Ery
Hmotnostní Cytometrie
Nový přístup využívající stabilní izotopy kovů
jako „značky“ spolu s jejich detekcí pomocí
atomové hmostnostní spektrometrie
 značky jsou spojeny s MoAb kompatibilními
s povrchovými i či intracelulárními znaky
 buňky jsou vaporizovány, atomizovány
a ionizovány, poté je měřena
základní kompozice
 simultánní detekce až 30
parametrů jedné buňky
bez nutnosti kompenzace
SPADE
Zobrazovací cytometrie
Flow cytometr se zobrazovacími a funkčními
vlastnostmi mikroskopu
 přímé zobrazení buněk s 60 násobným rozlišením
 simultánní fenotypové a funkční analýzy
s využitím 5 laserů a 12 zobrazení na buňku
Výhody a nevýhody FC
 FC analýza povrchových i intracelulárních markerů
je citlivá a kvalitativní metoda (lze i kvantitativně)
 simultánní analýza několika markerů na vysokém
počtu buněk
 paralela k morfologickému vyšetření - upřesnění dg.
chybí informace morfologická
občas nejednoduchá interpretace
flowcytometr a fluorescenčně značené protilátky jsou
poměrně drahé