Farmakogenetické a prediktivní aspekty protinádorové
chemoterapie:
historie, současnost a možnosti dalšího rozvoje
D a l i b o r V a l í k
Masarykův onkologický ústav, Brno
LF FÚ ACIU, Brno
Klinika dětské onkologie LF MU, Brno
nežádoucí účinky terapie (Lazarou et al., JAMA 1998)
(závažné nežádoucí účinky:
…definované jako ty, které vyžadují hospitalizaci nebo trvale poškodí
pacienta nebo vyústí v jeho smrt)
» = adverse drug reactions (ADR)
» …v roce 1994, v úhrnu 2,216,000
hospitalizovaných pacientů v USA mělo závažnou
ADR and 106,000 zemřelo na ADR…
Faktory variability v odpovědi na na
xenobiotikum:
• věk
Genetická
variabilita
Individualizovaná
dávka/režim
• pohlaví • dieta • funkce orgánů
genom hostitele
(toxicita způsobená léčbou)
genom léze (např.
tumoru)
(léčebný efekt)
• významné osobnosti, data a koncepty
– …osobnosti a data
– Mendel (1873)
» pojem dědičného transmisivního „faktoru“,…dnes
genu
– Garrod (1902)
» pojem chemické individuality
– Motulsky (1958)
» fúze biochemie, farmakologie a genetiky
– Vogel (1960)
» pojem farmakogenetika
– …koncepty
– „biomarker“:
» měřitelnost, malá pravděpodobnost spontánní změny,
správná reflexe studovaného jevu
– „dědičná porucha jako modelové onemocnění“:
» Garrod…whenever possible the genetic difference
should be measured as a chemical test
» …if we knew enough, every gene would be assigned a
specific chemical effect in the body
– „reakce fáze I a II“.
» Williams, 1963
pharmacogenetics through perspective of metabolic diseases
– „pharmacogenetic“ diseases as „siblings“ of
inborn errors of metabolism:
AAAa (a b,c,d,…i)aa
Allelic
configuration
healthy
healthy...unless
stressed
diseased
(Valik AACC, Baltimore, 2003)
DÁVKOVÁNÍ TERAPIE:
…BĚŽNÁ KLINICKÁ PRAXE
stanovení dávky vychází v naprosté většině případů z
přepočtu na tělesný povrch pacienta
- (BSA - Body Surface Area)
- …co hůře, někdy dokonce hmotnost
LIMITY ??
….stupeň korelace mezi BSA a dalšími
farmakokinetickými parametry jako např. Clearance
nebo AUC (Area Under Curve)
„přesnost versus správnost“
FARMAKOKINETIKA
akronym LADME v osudu léčiva
• L(iberation) = uvolnění z podané formy (tablety, čípky, im, iv
aplikace
• A(bsorption) = proces, kdy je molekula vychytána do systémové
cirkulace, (tento koncept neplatí pro iv podání léčiva)
• D(istribution) = jakmile je lék absorbován a rozptýlen v plasmě
může dále:
– zůstat v krevním prostoru (vazba na proteiny)
– opouštět krevní prostor a vstupovat do extravaskulární tekutiny
– migrovat do různých orgánů
• M(etabolism) = proces biotransformace léku většinou do
podoby hydrofilní, polárnější, a tak lépe eliminovatelné
– hlavními orgány biotransformace jsou: játra, ledviny (mikrosomální
enzymy)
koncept prodrug > active drug (CFM > 4-OH,CFM)
• E(limination) = finální exkrece léku
– ve formě parentální sloučeniny nebo biotransformovaných
metabolitů
– cesty eliminace - moč, žluč, expirovaný vzduch, sliny, pot, mateřské
mléko
akronym LADME v osudu léčiva
METABOLICKÉ BIOTRANSFORMACE
•reakce fáze I (léčivo se proměňuje v polárnější metabolit
připojením nebo odhalením funkčních skupin:
•-OH, -NH2, -SH
•reakce fáze II (tvorba vysoce polárních konjugátů se snadnou
eliminací):
•hlavním metabolickým orgánem jsou játra (ale i GIT,
plíce, kůže, ledviny)
FARMAKODYNAMIKA
Zabývá se interakcí léčivo - receptor
receptor
Aktivní lék v
místě receptoru
Kaf
Kdiss
Farmakogenetika
Zabývá se individuálním genetickým vlivem na:
farmakokinetiku (polymorfní metabolické enzymy)
farmakodynamiku (polymorfní receptor)
farmakogenetika
farmakokinetika farmakodynamika
kde nás farmakogenetika může zajímat
– …u chronických, dlouhodobých medikací
– …tam se nejvíce projeví sumační efekty (interakce,
komorbidita, genetické vlivy, apod.)
– psychiatrie
– antikoagulační terapie
–onkologie
…protinádorová chemoterapie
= „řízená toxikologie“
• …v zásadě všechny protinádorové léky mají úzké
terapeutické rozmezí
Source: Nature Reviews Cancer
hovoříme-li o“personalizaci“
medicíny:
..pojmy: i) odpověď hostitele versus
ii) odpověď léze
• odpověď hostitele:
– označujeme jako farmakogenetiku/genomiku
• odpověď tumoru:
– označujeme spíše jako „prediktivní onkologii“
…i) pacient jako hostitel
– v zásadě lze zlikvidovat jakýkoli nádor, jestliže jej
vystavíme dostatečné expozici cytotoxickým látkám
• …takový koncept je ale stěží kompatibilní s dávkováním „in
vivo“ umožňujícím přežití hostitele
– …přesto se objevila schémata jako „dose escalation concepts“
vedoucí k tzv. high-dose chemoterapii
…ii) tumor jako cíl
• „cílená terapie“,
– fokusovaná na selektivní determinanty přítomné
nebo aktivní v tumoru, nikoli v normální tkáni
– …cave !! recentní události s EPO…
• seznam používaných látek se rozšiřuje
– herceptin jako prototypový lék
… klinický problém: četné komorbidity
interferující s protinádorovou léčbou
– hypertenze
– diabetes mellitus
– dyslipidémie
– onemocnění srdce a mozkové příhody
– chronické onemocnění ledvin
– požívání léků alkoholu a parafarmaceutických preparátů
– virové infekce a jejich následky (hepatitis, etc)
• většinou mající nepříznivý vliv na funkci parenchymových orgánů důležitých v
metabolismu
– a současně
• vedoucí k polymedikaci
• …..významné u starších nemocných
…tzn. v současnosti před námi stojí
• polygenní modely s významnou negenetickou
komponentou
– (typicky: chronické choroby parenchymových orgánů)
– „multiple mechanisms influence a single trait“
– „…SNPs probably not enough…“(W.Evans, AACC 2007)
…příklady hlavních farmakogenetických
determinant protinádorové chemoterapie
CYTOCHROM P 450
• mikrozomální enzym zapojený v I. fázi metabolických přeměn při
oxidativních procesech
•hemoprotein, ve své redukované formě (Fe++ ) váže oxid uhelnatý a
tvoří komplex maximálně absorbující světlo vlnové délky 450 nm (
Omura, Sato 1964 )
•řada izoenzymů - nomenklaturní systém založený na rozdílné
sekvenci aminokyselin
•izoenzymy označovány CYP ( CYtochrom P450 ) 1A1
Tamoxifen Prodrug Metabolism
Goetz, M. P. et al. J Clin Oncol; 23:9312-9318 2005
SULT1A1
SULT1A1
CYP 3A4
• původně popsán na příkladu rozdílné oxidace nifedipinu
Kleinbloesem CH., van Brummelen P., Faber H., 1984
• teniposid, etoposid
• cyklofosfamid, ifosfamid
• vinkristin, vinblastin, vindesin
• paclitaxel a docetaxel
Inter-individuální variabilita v metabolizaci paclitaxelu v
závislosti na rozdílné expresi izoenzymů P 450
paclitaxel
CYP2C8 CYP3A4
6-alfa-hydroxypaclitaxel 3´- OH paclitaxel
UGT1 a IRINOTECAN, CPT 11
• derivát camptothecinu, inhibice topoizomerázy I
irinotecan
karboxylesteráza
SN38
UGT 1A1
SN38 glukuronid
SN-38-
glucuronide
UGT1A
DIHYDROPYRIMIDINDEHYDROGENÁZA
• 10 - 20 % 5-FU se vylučuje nezměněno močí
• až 80 % 5-FU je metabolizováno na 5-FDHU pomocí DPD
• ?? % zůstane k dispozici pro biotransformaci na
fluoropyrimidinnukleotidy pro vlastní cytotoxický efekt ??
….je obtížné dosáhnout klinické odezvy bez navození významné
systémové toxicity….
…naše projekty
• prof. J. O´Brien, BGL, Mayo Clinic,
• prof. J. Štěrba, KDO FN Brno
• Dr. M. Radina, OC NJ
• Dr. D. O´Kane, DCBI, Mayo Clinic
• prof. Steve Wong, Medical College of
Wisconsin
• Dr. A. van Kuilenburg AMC Amsterdam
Fluoropyrimidiny v terapii kolorektálního
karcinomu:
data MOÚ
Valuesinlogscale:LN[X+1]
AUC 5-FU (mmol.l
-1
.min
-1
)
Ratio of AUC values: 5-FU / DHFU
Mean value
95 % Confidence limits
AUC DHFU (mmol.l
-1
.min
-1
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
I II III IV
A
B
BB
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
I II III IV
A
A A
A
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
I II III IV
A
C
BC
B
A-C: marks of statistical significance
Variants marked by the different letter are
mutually statistically significant (p < 0.05).
plasma AUCs (5-FU, DHFU)
Table 5. Genomic data in relation to CHT-related adverse effects (pilot examination, N = 23)
Adverse effects severity score 1
- all % calculated within columns I-II
(N = 8) III - IV (N = 15) p level 2
Total number of mutations
per patient
1 0 % 20 %
2 – 3 50 % 40 %
4 - 5 50 % 40 %
0.180
Exon sequence variants 3
Exon 2
c. 85 T>C (T85C) 75.0 % 40.0 %
0.127
Exon 6
c. 496 A>G (A496G) 75.0 % 40.0 % 0.103
Exon 7
IVS7-118 A>G 50.0 % 46.7 % 0.878
Exon 23.3A
c. 3947 G>A (G3947A) 75.0 % 46.7 % 0.126
Exon 23.3B
c. 3959 C>T (C3959T) 75.0 % 53.3 %
c 4079 T>C (T4079C) 0 % 6.7 %
c. 4059 T>C (T4059C) 0 % 6.7 %
0.185
1
Score aggregating frequency and grade of toxic events, increasing from degree I (no toxic
effects of CHT) to IV (severe effects of high grade, elevated in time); see also Table 2.
Groups III and IV were summed due to similarity of data.
2
p level of applied statistical tests: M-L χ2
test for association between genomic data and
toxicity scoring
3
Only exons with relatively frequent mutations that allow statistical processing are included.
komentář k průběžným výsledkům …
• nejlepším indikátorem toxicity byla AUC5-FU/AUCDHFU
– nejde bohužel o prediktivní test
» je to ale pravděpodobně jediný test schopný také odhalit
deficienci DHP (van Kuilenburg, Clin.Cancer Res, 2003)
• pozorovali jsme významnou interindividuální variabilitu
v genu pro DPYP
– avšak bez vztahu ke klinicky manifestní toxicitě
• studie je prospektivní > shromažďujeme data o vztahu k
efektu
Biomarkery odpovědi na terapii v
dětské onkologii
high-dose methotrexate
úroveň studia:
genetická – MTHFR ,
proteomická – SELDI-TOF ,
metabolomická – plasmatické biomarkery
celulomická – exprese p53
DHF
5,10-CH2-THF
5-CH3-THF
Homocysteine
5,10=CH-THF10-CHO-THF
Formate
PURINES
Glycine Serine
dTMP
dUMP
THF
MethionineSAH
5-CHO-THF
B12
MS
TS
AICARFT
GARFT
DHFR
MTHFR
SGHMT
…souhrn fyziologie folátů
DNA synthesis
DHF
5,10-CH2-THF
5-CH3-THF
Homocysteine
5,10=CH-THF10-CHO-THF
Formate
PURINES
Glycine Serine
dTMP
dUMP
THF
MethionineSAH
5-CHO-THF
B12
MS
TS
AICARFT
GARFT
DHFR
DNA synthesis
MTX
MTHFR
SGHMT
…po podání methotrexátu
±1.96*Std. Err.
Mean
0
4
8
12
16
20
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
78
84
90
96
*
* *
*
*
*
0
20
40
60
80
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
78
84
90
96
*
*Homocysteine(µmol.l
-1
)
p < 0.001
Variance ratio:
32.3 %
Time (hours)
95 % Confidence limits Geometric meanFIGURE 1A
p < 0.001
Variance ratio:
88.81 %
±1.96*Std. Err.
Mean
0
4
8
12
16
20
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
78
84
90
96
*
* * *
*
*
*
Methotrexate(µmol.l
-1
)
0
20
40
60
80
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
78
84
90
96
*
*
Homocysteine(µmol.l
-1
)
Methotrexate(µmol.l
-1
)
BLOCK 1
BLOCK 2
p < 0.001
Variance ratio:
20.8 %
p < 0.001
Variance ratio:
87.2 %
Homocysteine
(averageAUC,µmol.1
-1
.h
-1
)
Methotrexate (average AUC total, µmol.1
-1
.h
-1
0h -?)
I. < 1000; II. 1000 - 1599; III. ≥ 1600
Geometric mean95 % Confidence limits
0
5
10
15
20
25
I II III
A
AB
B
0
5
10
15
20
25
I II III
A
AA
A. Folate ≤≤≤≤ 10 nmol.l
-1
B. Folate > 10 nmol.l
-1
ex vivo induction of p53 (bone marrow blast cells, prior to
any therapy)
Control, 0 hrs. Control, 24 hrs.
Methotrexate 40µmol, 24hrs. Methotrexate 120µmol, 24 hrs.
plasma concentration: MTX
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Další
,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
3 5 0 0 4 0 0 0 4 5 0 0
3 5 0 0 4 0 0 0 4 5 0 0
1 p l a s m a
2 p l a s m a
3 p l a s m a
4 p l a s m a
5 p l a s m a
6 p l a s m a
7 p l a s m a
8 p l a s m a
9 p l a s m a
1 0 p l a s m a
1 1 p l a s m a
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
SELDI TOF mass spectrometry Chip CM10, pH = 6, : plasma specimens
during MTX administration;
apparent difference at the molecular weight 3800Da.
This new peptide or protein is induced upon therapy with HDMTX
Skarby TV, et al: High leucovorin doses during high-dose methotrexate
treatment may reduce the cure rate in childhood acute lymphoblastic leukemia.
Leukemia. 2006 Nov;20(11):1955-62.
• HDMTX treatment of 445 children with ALL.
• …that high LV dose is related to higher risk for relapse.
Doubling of the LV dose increased the relapse risk by
22% (95% confidence interval 1-49%, P = 0.037).
• …results suggest that high doses of LV increase the risk for
relapse despite the fact that they were correlated with high
MTX levels and longer MTX elimination time.
“…Our philosophy [is] that chemotherapeutic agents are not only ends in
themselves but also serve as tools for unlocking doors and probing Nature’s
mysteries”
Dr. Gertrude Elion Nobel lecture 1988
Metabolism of 6-MP
Xanthine
oxidase
6-thiourate
o
TPMT
6-Methyl-
mercaptopurine
(6-MMP)
Azathioprine
6-Mercaptopurine
(6-MP)
HGPRT
PRPP
6-thioIMP
IMP
Dehydrogenase
NADNADH
DNA & RNA
Thiopurine
nucleotides
TPMT (Thiopurin S-methyltransferáza)
• deficit či snížená enzymová aktivita (1:300) - důsledek přítomnosti funkčních
polymorfizmů v kódující oblasti genu TPMT (6p22.3)
- v bělošské populaci 89% osob normální aktivita a 11% snížená aktivita
- do dnešní doby popsáno 27 funkčních polymorfismů
- nejčastěji se vyskytují deficitní alely označované TPMT*3A (55%), TPMT*3C,
TPMT*2 a méně častá TPMT*3B
Gen TPMT má délku 34 kb, skládá se z 10 exonů a
9 intronů a je lokalizován na chromozomu 6p22.3
Mezi nejběžnější polymorfizmy patří G238C,
G460A, A719G
Předpokládá se značná míra korelace genotypu
TPMT s fenotypem, který byl stanoven měřením
erytrocytární TPMT aktivity
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
0 1 2 3 4 5
Genotypy TPMT
AktivitaTPMT(nmol/hod/mlRBC)
*2/*3A *2/*1 *3A/*1 *1/*1 (wt)
Genotyp TPMT Počet pacientů
*1/*1 (wt) 86 (87%)
*2/*1 3 (3%)
*3A/*1 (*3B/*3C) 9 (9%)
*3A/*2 1 (1%)
*3B/*1 0 (0%)
*3C/*1 0 (0%)
Celkem 99
Rozložení aktivity enzymu TPMT v našem souboru v závislosti na zjištěném genotypu
n=99
Rozložení aktivity enzymu TPMT v závislosti na zjištěném genotypu
n=99
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Početjedinců
Aktivita TPMT (nmol/hod/mlRBC)
*2/*3A *2/1 *3A/1 wt 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Aktivita TPMT (nmol/hod/mlRBC)
Početjedinců
Vzhledem k tomu, že uvedené polymorfizmy a
nerovnoměrné rozložení aktivity TPMT v
populaci může způsobovat velké rozdíly v
účinnosti léčby,je komplexní farmakogenetické
vyšetření zahrnující stanovení aktivity TPMT a
příslušného genotypu před začátkem léčby
velmi dobrým nástrojem pro určení vhodného
dávkování léčiva.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TPMT*1 (wild-type)
TPMT*2
G238C
(Ala→→→→Pro)
TPMT*2
TPMT*3A
G2460A
(Ala→→→→Thr)
A719G
(Tyr→→→→Cys)
Otec pacienta – genotyp TPMT*1/*2
Pacient – genotyp TPMT*2/*3A
Gen TPMT má délku 34 kb, skládá se z 10 exonů a 9 intronů a je lokalizován na chromozomu 6p22.3. Šedé úseky znázorňují
exony s otevřeným čtecím rámcem, bílé úseky pak nepřekládající se části genu, zelené boxy jsou vyšetřované lokusy v exonu
5, 7, a 10, oranžové boxy představují lokusy, kde byla detekována mutace. Otec pacienta je nositelem mutace TPMT*2
(asociována se sníženou aktivitou enzymu) - heterozygotní genotyp TPMT*2/*1 s aktivitou enzymu 13,4 nm/hod/mlRBC.
Pacient je složený heterozygot pro všechny tři sledované mutace v genu TPMT. Výrazně snížená aktivita TPMT (2,4
nmol/hod/mlRBC) koresponduje se zjištěným genotypem.
závěr…farmakogenetické vyšetření
statutu/dráhy TPMT
• Proč…?:
– dávkování, toxicita
• Jak…?:
– komplexním korelativním vyšetřením genotyp/fenotyp
• Je-li dostatečno…?:
– není (!), pro úplnost je třeba ještě farmakodynamický
parametr v čase, tj zde vyšetření thioguaninových
nukleotidů v průběhu léčby
Farmakogenetika 2011…
kde pramení jistý skepticismus …?
– …pojmy:
» farmakogenetika versus prediktivní onkologie
– …často pouze suplement fenotypových testů:
» Warfarin+INR, UGT1A1+bilirubin, antihypertensiva+TK
– …relevantní biomarkery:
» prof. Lindpaintner…“genotype may be the wrong place to
look for biomarkers for drug response…“ (BMJ 2007:3,334)
– …faktor času:
» tamoxifen versus inhibitory aromatázy,…co se bude používat
v klinice ?
evidence-based medicine
versus
personalized medicine
– >…mohou-li být tyto dva koncepty vůbec kompatibilní?
– EBM je postavena na robustních skupinových statistikách, které vedly k
vývoji protokolů
– whereas personalized medicine operates with rate of deviation from „group
average“
• >>?…lze-li studovat personalizovanou medicínu pomocí standardních
metod klinických zkoušek
– …čas znovu studovat „personifikovatelné“ proměnné, vč klinických známek
(individuální toxicita, apod.)
– to adopt some degree of toxicity as efficacy marker…? (Capizzi 1997)
…závěrem
• …co bychom potřebovali v klinice:
• I) prediktivní a individualizovanou informaci o:
– toxicitě
– lékových interakcích – jak potenciace tak suprese
• II) individuálně interpretovatelnou informaci o
– adjustaci dávky – nejlépe i v čase
– výstupy:
• pravděpodobně nepůjde o jeden metodický přístup
– nástroje: analýza drah, biomarkery, (genetické, solubilní, klinické ?)
…one sometimes needs to find the place to get
inspired…