Tvorba biofilmu u mikrobů izolovaných z klinického materiálu
•          MUDr. Černohorská Lenka, Ph.D.
•
bio2 bio2 van

* Kdo tvoří biofilm (bakterie, viry, kvasinky, 1druh, více druhů, multibakteriální komunity)
* Kde se tvoří biofilm (většinou na pevných površích)
* Jak se tvoří biofilm (složitým mechanismem viz. dále)
* Proč se tvoří biofilm (ochrana před růz. nepříznivými vlivy)
*

Kdo tvoří biofilm?
•P. aeruginosa
•S. koagul. neg.
•K. pneumoniae
•E. coli
•S. aureus
•E. faecalis
•A. baumanii
•aj. (téměř všechny bakterie, kvasinky a plísně)
lou_p

Kde se tvoří?
* Katetry a cévky
* Kontaktní čočky
* Zubní implantáty
* Náhrady aj.
* Vodovodní trubky
* Na zubech – zubní plak, spolupodílí se  na vzniku kazu v případě vysoké konzumace cukrů a
nečištění zubů
* Na kamenech v řece - fyziologické na rozdíl od jiných!
*

Vznik biofilmu
* Na začátku je pevný povrch a plovoucí bakterie          +
* Bakterie adheruje na povrch
* Následuje agregace dalších bakterií
* Bakterie začnou produkovat polysacharidovou matrix
* Až vznikne třídimenzionální struktura zvaná biofilm
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v
v

Vznik biofilmu v časovém sledu
•
•
•
•
•
•
•
•                      Pro zájemce na www.medmicro.info
Tol 01

Význam tvorby biofilmu u bakterií
•Tvorba biofilmu je spojována s virulencí!
•    Bakterie se stávají odolnější vůči:
•
v antibiotikům
v imunitní reakci hostitele
v dezinfekčním prostředkům
v
•Biofilm tvořící bakterie jsou původci až 65% nosokom. infekcí v USA
•
•

Mechanismy ovlivňující rezistenci na antibiotika
* Vliv povrchového náboje
* Snížení růstové rychlosti
* Penetrační bariéra ?
* Nehomogenní matrix
* Fenotypové odlišnosti
* Intercelulární signalizace
* Imunitní mechanismy...
HM00363_

Průkaz biofilmu
v
v
vVe zkumavkách či destičce dle Christensena1
•      kultivace mikroba, výplach planktonických bakterií + obarvení bakterií lnoucích ke stěně –
modrá souvislá vrstva na stěně zkumavky nikoliv prstenec či sediment – to je biofilm!
v
vPrůkaz ve zkumavkách obarvených alciánovou modří
v
vPomocí el. mikroskopie, SEM, TEM
•
vSpeciálními kultivátory a jinými fenotypickými metodami
v
vGenotypovými metodami (PCR, FISH) aj.
•
v
•
•
•
v
v
v
v
v
•
v1
lenka
vPOZ
vNEG
v1

Stanovení citlivosti bakterií v biofilmu
vKultivace bakterií v “mikrotitrační“ destičce v médiu
v
vPo výplachu planktonických bakterií přidáme naředěné antibiotikum (kombinace ATB) a znovu
kultivujeme
v
vStanovení MBEC (minimum biofilm eradication concentration) – různé vědecké skupiny – různá
označení - ve srovnání s MIC (minimum inhibitory concentration) mnohonásobně vyšší hodnoty
(4x-1024x), leží nad break pointem daného antibiotika
v
vK eradikaci nelze použít 1 ATB, pokusy o stanovení  synergismu 2 antibiotik, složitý vzorec, zatím
jen pro výzkum
v
vNutno znát klinické souvislosti (tj. stav pacienta)
*

Srovnání MIC a MBEC hodnot
vMIC           MBEC
v
v

Citlivost na ATB u kmene
P. aeruginosa 320
v* Bakterie MIC „citlivá“,  MBIC  4x - 256x vyšší než MIC (mg/l)

v PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI  CIP  GEN  TEI  VAN
v
vKontrola růstu
v Stanovení MBEC

Doporučení a eradikace
* Stanovení MBEC  je u bakterií tvořících biofilm vhodnější než stanovení MIC
* U pacientů nereagujících na léčbu stanovit synergy efekt , bakterie původně necitlivá na
jednotlivá ATB je citlivá ke kombinaci  ATB
* U mikrobů rezistentních i ke kombinacím antibiotik, zůstává jedinou možností vyjmutí
biofilomového ložiska (katetrů, kloubních náhrad, zubních implantátů aj.)
* Možnosti prevence: katetry potažené antimikrobiál. substancemi např. minocyklinem a rifampicinem,
proplachy, hygiena…
*
wb01770_

1 – Mikroskopie orálního biofilmu
* V preparátech barvených Gramem lze pozorovat shluky G + i G- bakterií a buňky makroorganizmu
(epitelie apod.)
* Jiná barvení, např. alciánovou modří znázorní polysacharidový materiál (nebuňěčné části biofilmu)
Alcian 02

v2 – Vliv čištění zubů na orální biofilm
detekce plaku - erytrosin
v   Dobrovolník má připravenou tabletku s barvivem barvícím zubní plak. Nechte tabletku působit v
dutině ústní cca 2 min. Zakreslete, kde se nejvíce usazuje zubní plak

* Klasická kultivace v bujonu: Uvolní se bakterie v planktonické formě. Bakterie ve formě biofilmu
se neuvolní
* Semikvantitativní metoda: Umožňuje zmapovat povrch katétru a semikvantitativně posoudit nález,
nevypovídá však o bakteriích v lumen
* Sonifikace: rozrušuje biofilm na povrchu i v lumen katétru. Vyočkováním určitého objemu vzorku
lze posoudit množství mikrobů
3- Katetry

4 – Vliv přítomnosti sacharidů na tvorbu zubního plaku
* Posuďte vliv příjmu různého množství sacharidů ve stravě na rychlost tvorby biofilmu u
kariogenního Streptococcus mutans
•Jaké závěry vyplývají z tohoto pokusu ohledně množství sacharidů ve stravě, délce jejich setrvání
v dutině ústní ?

* MIC určuje minimální inhibiční
•   koncentraci ATB u planktonické formy
* MBEC je nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu (žádné živé
buňky, pH beze změny - důlek zůstává červený). Vypovídá lépe o skutečném účinku antibiotika na
bakterie žijící ve formě biofilmu
5 – MIC versus MBEC
1