DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay fluoroimunoanalytická metoda firma Wallac Oy - LKB Pharmacia (fin.) stanovení nízko- i vysokomolekulárních analytů • velmi citlivá • velmi specifická časově modulované měření fluorescence chelátu lanthanidů • Europium • Terbium • Sammarium • Dysprosium DELFIA - p Drincip Protilátka nebo antigén označeny fluorescenční sondou • chelát lanthanidu, nejčastěji Europia Po proběhlé imunochemické reakci: přidání „zesilovacího" roztoku ke vzniklému komplexu • odtržení Eu z komplexu přeměna Eu na nový intenzivně fluoreskující chelát fluorescence s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra - rozdíl mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence vzorek pulzně excitován UV zářením (340 nm) fluorescence měřena v dlouhovlnné části VIS spektra - př. Europium 620 nm Ehcila'iün 350 4IXJ Tli- +50 500 550 i--.ii: Tb Dy Eu Sm □ fluorescence je dlouhodobá - (řádově stovky mikrosekund) -1- 600 Emission (nm) DELFIA - Chelátové značení p Cheláty komplexní (koordinační) sloučeniny centrálního atomu a dvoj-nebo vícevazných ligandů ligandy tvoří s centrálním atomem cyklická uspořádání • chelátový efekt - významné zvýšení stability komplexů ve srovnání s jednovaznými ligandy použitý chelát musí být hydrofilní, stabilní a snadno navázatelný na protilátku nejčastěji cheláty lanthanidu s izothiokyanátofenyl-deriváty polyaminopolyoctových kyselin (EDTA, DTTA, DTPA,...) 6 COOH COOH COOH COOH S = C = N N N N 0 /{\ coo- coo- coo-coo COOH COOH FIA - Chelátové znače Označení protilátky chelátem nesmí ovlivnit vlastnosti protilátky - afinitu, specificitu, rozpustnost reakce izothiokyanátové skupiny chelátu a aminoskupiny lysinu v proteinovém řetězci protilátky: Eu-DTTA-^~~^-N=C=S + H-N-Protein- /=v » Eu—DTTA-^ ^-NH-C-NH-Protein oddělení značené protilátky od nadbytku nenavázaného chelátu - gelová filtrace • oddělení značeného antigénu od nenavázaného chelátu - HPLC eluát z kolony monitorován při 280 nm, jímá se odpovídající frakce Značená protilátka - ..... ••••• 00 oo a volný chelát m Zrnka gelu-p -0 0 00 00 oo oo oo o o Kolona-*~ 00 0°P 0 0 o7 00 00 oo ©.© ©o oo í& '280 IgG - Eu Agregáty IgG Volný Eu chelát Elučni objem - kompetitivní: - fluorescenční sondou značený antigén - intenzita fluorescence nepřímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku - nekompetitivní (sendvičové): - fluorescenční sondou značená protilátka - intenzita fluorescence přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku DELFIA - disociace lanthanidu z komplexu, vznik fluorescenčních chelátů ion lanthanidu z komplexu odtržen vlivem kyselého pH přeměněn na vysoce fluorescenční chelát přidáním přebytku luminoqenního ligandu vhodnými ligandyjsou p-diketony: R1-C(=0)-CH2-C(=0)-R2 - R1... světlo absorbující aromatická skupina, např. naftyl-, benzofuryl-, furyl-, thienyl-, atd. - R2... fluorovaný uhlovodíkový zbytek, v molekule zajišťuje optimální rozložení elektronové hustoty pro tvorbu komplexu - ligand se váže na koordinační místo lanthanidu svými dvěma ketoskupinami výběr luminogenního ligandu závisí na energetických požadavcích konkrétního lanthanidu • excitovaná energetická (tripletová) hladina ligandu musí ležet mírně výše než emisní hladina iontu Kyselý reakční roztok kromě ligandu obsahuje • detergent • pomocné reagencie • udržují výsledný chelát ve formě micel DELFIA - Time-resolved fluoromet fluorescence - intenzivní a dlouhodobá • doba emise delší než u běžných fluoroforů - řádově stovky mikrosekund Excitation 1 = 340 nm __ _L 40D 800 Delay time Counting time 1000 cycles/s Time (ps) vzorek pulzně excitován vlnovou délkou 340 nm fluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekund • V době, kdy už vyhasla fluorescence pozadí vlastní měření - 400 mikrosekund cyklus (pulsní excitace - prodleva - měření) trvá 1 milisekundu během měření vzorku (1 sekunda) se 1000x opakuje DELFI vysoká citlivost vysoká specifičnost Intrtasituf Atmfyw Conctntr/ttíoti .11 I ■ ConvcntiottafEÍA ConventionalFIA Radi ítiiamtivaasíňy Luminescence DEL FIA assays are done using thE principle of Time resolved FlLiofmetry- ; - Hence high levels af analytical Sensiuviw & Specificity are maintained E L F J A i Dissociation : Enhanced : Lanhianide : Fljoro : Iminuna : Assay D Fluorescence lanthanidů: úzké emisní píky při různých vln. délkách různá doba trvání fluorescence při měření se nepřekrývají vlnové délky ani časy odečtu fluorescence Eu-značená Inkubace 600 Emission (nm) paralelní stanovení až čtyř analytů použití chelátu Tb a Dy jako 3. a 4. fluorescenční značky vedle Eu a Srn • nutno použít v reakční směsi další luminogenní ligand fluorometry s možností TRF a automatické korekce překryvu stanovení čtvrtého analytu (Dy) -horší citlivost DELFIA - praktické provedení práce v mikrotitračních destičkách - specifická protilátka (obvykle monoklonální) navázána na pevné fázi vznik značeného komplexu v jamce destičky promytí komplexu přidání tzv. Enhancement Solution luminogenní ligand - silně kyselý pufr - detergent ■ odtržení stabilního chelátu z komplexu, přeměna na fluoreskující chelát ■ měření fluorescence - TRF fluorometr ■ v prvních jamkách destičky dávkovány kalibrátory - kalibrační křivka DELFIA - lze plně automatizovat při práci s kapalným materiálem (plasma, sérum) při práci se suchou krevní skvrnou není dosud běžná automatizace prvního kroku (vyraženi terčíku) i J®®®®»®®®£®® e®®®®®®®®®®® ®®®®®®®®®®®g ®®®®®®®®®®»® 5®®®®®®®®®£®J ; ®®®®»®®®®®®® plaleiTot 3 lne Pot 1 R««gPot T ol 6/8 Prifftr Irii 1 Piinl plálo | PrírtcpifliP Mea>uie | \ hyum\ I Bltllllf Tumi>ui ScIOl r.iri.l Anrmn/fJIh i I .<'! Snmpln Code: Fi" _-J Pie-dilulion Add luhci K R«pl.: F~ r r J Rmnpde ^ I"" nionii DELFIA - praktické provedení Diagnostický set - mikrotitrační destičky, roztoky, kalibrátory, kontroly Umístění kalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků na destičce • kalibrátor # kontrola # pacient Softwarově zpracovaná kalibrační křivka kompetitivní uspořádání sendvičové uspořádání - «.H O SO - 9. M 1*-« ■ 2. IBB > tutci .iiMJUiw.Min. :ii BJTC ■ - iwi-í W.-.11.h1 : l~p :roacEFT fitt«i řuscFinn - m in mmcp i**w»« wno - ť» MM gjgjWj ai" «ww_aniMiP «1» CM í*LC.CO»S ffllfr I : 123b: STB Qi1€ *«. ».«o t.nt nu *•**»*• 1.1 .-■.■>. r.--,' tnoo a.2 M.» za.as -i.4í taní Jéľ iS:S m -J:S iSSS s ii-j»h».»i . . i .................. -1 Ä-MI3 M- / sula : LOG US / MBI5 / r«f Š sul* i h.bwiiir.->1M1 a / mmi ftLDHIIltl / SPLEME 3H01HKD / CMC rwp in Z' ■ ITHMTIDB i Z i / I.Z 1.5 1 Z Slil zn SM DELFIA - vvužití -vy o DELFIA lze použít pro široké spektrum analytů - chelátem lze označit každou sloučeninu obsahující amino- nebo karboxyskupinu Proteiny Peptidy Oligonukleotidy Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,...) Např. proteiny, hormony - tyroidní panel (TSH, T3, T4, fT3, fT4, TBG, protilátky proti tyroidní peroxidáze a tyreoglobulinu) - reprodukční hormony (HCG, FSH, LH, estradiol, progesteron, prolaktin, testosteron, SHBG) - screening v těhotenství (free-pHCG, HCG, estriol, AFP, PAPP-A) - inzulín, růstový hormon, cytokiny - PSA a další Analytické postupy diagnostické sety a automatizované uzavřené analytické systémy postupy vypracované přímo v laboratoři Využití DELFIA - novorozenecký s DELFIA + suchá krevní skvrna | kapka kapilární krve z patičky novorozenců odebrána na na kartičku filtračního papíru • ze suché krevní kapky vyražen terčík J^\. • extrakce analytu z terčíku 1 • použití extraktu k analýze ' 1963 - poprvé použita suchá krevní skvrna - screening metabolických poruch novorozenců - prof. Guthrie (USA) NS - vyhledávání novorozenců se zvýšeným rizikem některých vzácných onemocnění • odběr krve všem novorozencům 3. den po narození • stanovení specifických markem pro vyhledávané choroby Novorozenecký screening (DELFIA) v ČR TSH - kongenitální hypotyreóza k , - vrozená snížená funkce štítné žlázy fm 17-hydroxy-progesteron - kongenitální adrenální hyperplazie - vrozená nedostatečnost tvorby hormonu nadledvin jfc^^feftř ^ WMffi Imunoreaktivní trypsinogen IRT - cystická fibróza - vrozená porucha transportu chloridů DELFIA (suchá krevní skvrna) 1 Vyrážení terčíků (razička) 2 Dávkování činidel 3 Inkubace, třepání 4 Odstranění terčíků z jamek 5 Promytí destičky 6 Měření na fluorometru po (vakuová odsávačka) (promývačka) přidání zesilovacího roztoku říkladv další Stanovení aktivity kiná • enzymy proteinkinázy fosforylují určité aminokyseliny v peptidickém řetězci posouzení úrovně fosforylace pomocí Eu-značených protilátek proti fosforylovaným aminokyselinám Metody s Eu-značenými oligonukleotidy • využití Eu-oligonukleotidů pro detekci a kvantifikaci amplifikačních produktů - např. pro detekci genových mutací, virů atd. Metody založené na sledování syntézy DNA (např. studium buněčné proliferace) • zabudování pyrimidinového analogu 5-bromo-2'-deoxyuridinu do nově syntetizovaných řetězců DNA místo thymidinu imunochemická detekce Eu-značenými monoklonálními protilátkami proti 5-bromo-2'-deoxyuridinu Sledování interakcí ligand - receptor • jeden z dvojice pomocí streptavidinu - biotinu fixován na mikrotitrační destičce proti druhému namířena Eu-značená protilátka rozinkináza Děkuji za pozornost ale i těm, kteří se nudili!