Úvod

S každým měřením  a tedy i s každou metodou používanou v biochemických laboratořích je spojena typická sada vlastností, které jsou obecně nazývány výkonnostní charakteristiky metody. Jejich úroveň vypovídá o možnostech měření realizovaných touto metodou a jsou proto určujícím faktorem použitelnosti metody pro požadovanou aplikaci.

Úroveň analytických vlastností metody je zároveň určujícím faktorem pro možnost její aplikace ke klinickým účelům. O základních analytických vlastnostech metody by proto měl mít povědomí také každý lékař, který její výsledky měření využívá.

Proces, jehož cílem je vedle stanovení funkčních charakteristik metody i komplexní posouzení její vhodnosti pro zamýšlený klinický účel použití, se nazývá validace metody. Jeho realizace je nedílnou součástí vývoje metody. Základní analytické vlastnosti metody jsou prověřovány i před zahájením používání metody v laboratoři a jsou rovněž předmětem pravidelné kontroly během jejího praktického rutinního využívání. V tomto případě se hovoří o verifikaci metody.

Soubor operací, které jsou v laboratoři prováděny s cílem zajistit odpovídající věrohodnost výsledků měření, je širší. Obecně jsou tyto činnosti označovány pojmem kontrola kvality.  

Tento soubor činností je určen především k zajišťování kvality vlastního analytického procesu v klinické laboratoři. V souladu s obecnými trendy jsou však i ve zdravotnických laboratořích zaváděny komplexní systémy managementu kvality, které slouží k řízení všech činností v laboratoři s cílem nejen udržení ale i  postupného zlepšování kvality poskytovaných laboratorních služeb.  Zavádění takových mechanismů do řízení laboratoře je prověřováno a osvědčováno nezávislými orgány v procesech certifikace nebo akreditace a postupně je požadováno i plátci zdravotní péče.

 

Výkonnostní charakteristiky analytické metody

Mezi základní analytické vlastnosti metody patří bezesporu dvě charakteristiky označované   pojmy preciznost (precision) a pravdivost (trueness). Za jejich projekci do konkrétního výsledku měření pak lze považovat vlastnost tohoto výsledku označovanou pojmem přesnost (accuracy).

Dříve byl pro pojem precision jako český ekvivalent používán výraz přesnost a pro pojem accuracy český ekvivalent správnost. Dnešní české termíny byly zavedeny v souladu s překladem mezinárodní metrologické normy TNI 01 0115:2009 Mezinárodní metrologický slovník - Základní a všeobecné pojmy a přidružené termíny (VIM).

 

Preciznost

Těsnost souhlasu (shody) mezi nezávislými výsledky měření získanými za předem specifikovaných podmínek.

Preciznost měření je číselně vyjadřována mírami nepreciznosti postihujícími rozptýlení mezi nezávisle získanými výsledky, například směrodatnou odchylkou, rozptylem nebo variačním koeficientem.

Preciznost je vyhodnocením dopadu existence náhodných chyb při měření, které nelze nikdy eliminovat a jejich velikost je vlastní určité metodě resp. konkrétnímu postupu měření. Tyto chyby jsou způsobeny náhodnými vlivy (nestabilita přístrojů, kolísání okolních podmínek měření např. teploty, výkyvy v činnosti operátora apod.). Výsledkem jejich působení je vznik rozdílů mezi výsledky opakovaných měření. Ty jsou při dostatečném počtu opakování, díky náhodnosti svého původu, rovnoměrně rozptýleny kolem své průměrné hodnoty. Přitom platí, že nejčastěji se vyskytují minimální odchylky a směrem k vyšším hodnotám odchylek se jejich počet snižuje. Rozdělení četností odchylek odpovídá normální (Gaussově) distribuci. Mírou rozptýlení, tedy nepreciznosti, výsledků tak je směrodatná odchylka s. Protože je uváděna v jednotkách měřené veličiny a závisí na její velikosti, používá se raději její relativní vyjádření, tj. variační koeficient CV uváděný v % (někdy označován rovněž jako relativní směrodatná odchylka).

Preciznost metody není stejná v celém pracovním rozsahu metody. Její závislost na velikosti měřené veličiny se nazývá profil preciznosti a je důležitým měřítkem kvality měřící metody. Nejnižších hodnot dosahuje variační koeficient ve střední oblasti rozsahu měření, zatímco k jeho koncům se zvyšuje (především v oblasti velmi nízkých hodnot měřené veličiny významně roste). Velikost nepreciznosti ovlivňuje reálný pracovní rozsah metody. Jednou z podmínek pro jeho volbu může být, aby CV nepřesahoval požadovanou úroveň, např. 10% - viz Obr. č.6.

Předem specifikovanými podmínkami měření v definici pojmu preciznost mohou být podmínky opakovatelnosti nebo reprodukovatelnosti.

Podmínka opakovatelnosti měření zahrnuje stejný postup měření, obslužný personál, měřicí systém, pracovní podmínky a stejné místo, a opakování měření na stejném nebo podobných objektech v krátkém časovém úseku.

Podmínka reprodukovatelnosti měření zahrnuje různá místa, obslužný personál, měřicí systémy a opakování měření na stejném nebo podobných objektech. Poměrně velká vůle v nastavení těchto podmínek vyžaduje vždy bližší specifikaci, které faktory byly proměnné.

Specifické podmínky reprodukovatelnosti zahrnující měření provedená sice stejným postupem, na stejném místě a opakováním měření stejných nebo podobných objektů ale v rozšířeném časovém úseku jsou označovány jako podmínky mezilehlé preciznosti měření. Realizace měření v průběhu delšího časového intervalu může postihovat vliv dalších variabilních faktorů, jako např. změny kalibrací nebo  kalibrátorů, změnu šarže používaných reagencií, resp. změny operátorů. Preciznost stanovená za těchto podmínek nejlépe vypovídá o kvalitě realizace metody v konkrétních podmínkách dané laboratoře.  

 

Pravdivost

Těsnost souhlasu (shody) mezi průměrnou hodnotou získanou z velkého počtu výsledků měření a skutečnou hodnotou resp. přijatou referenční hodnotou x₀. Mírou pravdivosti metody je její odchylka (bias - b):

nebo v relativním vyjádření:

Skutečná (pravdivá) hodnota měřené veličiny je v praxi z principu nedostupná, mohla by být získána pouze dokonalým měřením. Proto se nahrazuje přijatou referenční hodnotou jako nejlepší praktickou aproximací skutečné hodnoty veličiny. Referenční hodnota se obvykle získá na základě měření veličiny konsenzuálně přijatou referenční metodou nebo jiným všeobecně uznaným postupem (například měřením ve vybraných referenčních laboratořích apod.).

Pravdivost metody je určena existencí systematické chyby provázející měření. Tento druh chyby může ovlivňovat výsledek měření buďto konstantním způsobem (výsledky jsou posunuty o stále stejnou hodnotu), proporcionálně (tedy o stále stejný násobek) anebo se může jednat o kombinaci obou způsobů. V této souvislosti se pak hovoří o konstantní a proporcionální složce systematické chyby.

Zatímco náhodných chyb se při měření nemůžeme zbavit (lze jen ovlivnit jejich velikost), systematické chyby měření je někdy možné vhodnými úpravami eliminovat nebo alespoň z části korigovat.

 

Přesnost

Těsnost shody mezi změřenou a pravou hodnotou měřené veličiny. Tato vlastnost se dotýká jednoho výsledku měření a je vlastně aktuálním projevem kombinace preciznosti a pravdivosti metody. Jedná se o příspěvek náhodné (RE) a systematické chyby (SE), který nastal právě v okamžiku konkrétního měření. Součet obou těchto příspěvků se označuje jako celková chyba měření (TE).

Jak bylo uvedeno výše, je u dané metody míra příspěvků náhodné složky chyby vyjádřena odhadem směrodatné odchylky s, mírou příspěvků systematické složky chyb je odchylka b. Pomocí těchto dvou parametrů je možno s určitou mírou spolehlivosti vyjádřit velikost celkové chyby měření realizovaných touto metodou:

Koeficient k se volí podle úrovně požadované spolehlivosti:1,65 pro 95% nebo 1,96 pro 99%.

 

Souvislosti mezi precizností a pravdivostí metody

Jak již bylo uvedeno výše, vzájemné spolupůsobení obou těchto charakteristik v určitém časovém intervalu realizace měření rezultuje v konkrétní úrovni přesnosti daného výsledku měření (viz Obr. č.1).

Obr. č. 1: Vztah mezi pojmy preciznost, pravdivost a přesnost měření

V závislosti na úrovní obou charakteristik lze posuzovat celkovou kvalitu metody. Tuto souvislost názorně postihuje příklad s kvalitou střelby na terč, uvedený na Obr. č. 2. Se zlepšující se kvalitou metody se zároveň zlepšuje i další vlastnost metody, kterou je její nejistota (viz dále).

Obr. č. 2: Souvislost mezi precizností a pravdivostí metody a jejich vliv na úroveň nejistoty metody

 

Nejistota výsledku měření

Nejistotou se rozumí parametr přidružený k výsledku měření, který charakterizuje míru rozptýlení hodnot, jež by mohly být důvodně přisuzovány měřené veličině.

Koncepce nejistot nahradila v současné metrologii dřívější koncepci chyb. Na rozdíl od ní lépe postihuje skutečnost, že výsledek měření je s jistou neurčitostí jen odhadem reality. To znamená, že nejde o bodový odhad hodnoty vzdálený od reality o stanovenou chybu, ale že se s určitou spolehlivostí nachází v ohraničeném intervalu možných hodnot. Znalost nejistoty umožňuje lépe porovnávat výsledky měření navzájem, nebo například s referenčními intervaly. Odhad nejistoty výsledků měření získaných danou metodou je zároveň součástí její validace,   kdy přispívá k posouzení, zda metoda je pro požadovaný účel dostatečně vhodná.

Princip určení nejistoty spočívá ve vyhodnocení efektů, které mohou působit na výsledek měření a následně v odhadnutí intervalu, o kterém je s určenou mírou spolehlivosti možno tvrdit, že se uvnitř nachází skutečná hodnota měřené veličiny. Celková nejistota je výsledkem spolupůsobení mnoha zdrojů. Efektem každého z nich je jeho individuální příspěvek k výsledné nejistotě. Tento příspěvek je označován jako složka nejistoty. Kvantitativní vyčíslení příspěvku některých složek může být získáno ze statistických distribucí výsledků série měření, charakterizovaných jejich experimentální směrodatnou odchylkou (tzv. složky nejistot typu A). Vyčíslení příspěvku jiných složek se získá z pravděpodobnostních funkcí založených na zkušenostech nebo jiných informacích (tzv. složky nejistot typu B). Číselná hodnota každé složky nejistoty převedená do podoby směrodatné odchylky se nazývá standardní nejistotou a označuje se symbolem ux (index x vyjadřuje příslušnost ke složce x). Nevýznamné příspěvky standardních nejistot se pominou a ostatní se sloučí podle zákona šíření nejistot do tzv. kombinované nejistoty u_C:

Pozn.: výše uvedený algoritmus je značným zjednodušením provádění odhadu nejistoty měření a současně není jediným možným postupem.

V praxi se uvádějí výsledky měření doprovázené tzv. rozšířenou nejistotou U_C, což je vlastně kombinovaná nejistota vynásobená koeficientem rozšíření k tak, aby odhad nejistoty odpovídal požadované úrovni spolehlivosti. Pro 95% pravděpodobnost má koeficient hodnotu 1,96, ale v praxi se obvykle používá jeho zaokrouhlená hodnota 2:

Výsledek konkrétního měření je pak prezentován jako hodnota zjištěná měřením doprovázená rozšířenou kombinovanou nejistotou, např.: 132 ± 6 nmol/l.  

Vedle zdrojů nejistot, které jsou spjaty s vlastní analytickou metodou, zahrnuje výsledná nejistota výsledku měření i příspěvky zdrojů uplatňujících se především v preanalytické fázi vyšetření. Viz Obr. č. 3.

Obr. č. 3: Hlavní zdroje nejistoty laboratorního vyšetření v klinické laboratoři

Význam uvádění nejistoty tkví nejen ve vyjádření jisté míry neurčitosti výsledku, který se s danou pravděpodobností může vyskytovat v celém vymezeném intervalu, ale je důležité s nejistotou výsledku počítat při jeho interpretaci vzhledem k rozhodovacím limitům, především pokud se k těmto limitům přiblížuje.

 

Návaznost metody

Návazností metody se rozumí vlastnost výsledku měření, pomocí níž může být výsledek vztažen ke stanovené referenci přes dokumentovaný nepřerušený řetězec kalibrací, z nichž každá se podílí svým příspěvkem na stanovené nejistotě měření.

Jedná se o velmi důležitou vlastnost metody s ohledem na dosažení její optimální pravdivosti. Pokud v metodě existuje návaznost každé ze vstupních hodnot veličin, jež jsou zahrnuty do modelu měření, až na základní jednotku SI, pak lze považovat zajištění návaznosti metody za optimální a výsledky měření mají předpoklad být v širokém mezinárodním měřítku srovnatelné. Prakticky to znamená, že především u kalibrátorů používaných v postupu měření je požadováno jejich navázání na standardy vyšší metrologické kvality. Tento princip je zajišťován pomocí existence hierarchické struktury referenčních materiálů a metod, pomocí nichž je pracovní kalibrátor postupně navazován až na nejvyšší standard optimálně až na jednotku SI. V této hierarchii vystupují současně také různé subjekty, které realizací jednotlivých kroků zajišťují.  

Obr. č. 4: Hierarchie kalibrace a metrologická návaznost na SI

Pozn.: podle ČSN EN ISO 17511:2004;
CGPM – Všeobecná konference pro váhy a míry, BIPM – Mezinárodní úřad pro váhy a míry,
NMI – národní metrologický institut,  ARML – akreditovaná referenční měřicí laboratoř, ML – laboratoř výrobce

Setkáváme se s několika typy standardů (referenčních materiálů) vystupujících na různé úrovni:

• primární referenční materiál - substance s maximálně dosažitelnou čistotou, jeho navážením nebo odměřením objemu vzniká materializovaná jednotka měření
• sekundární (certifikovaný) referenční materiál - obvykle má matricový charakter (obsah proteinové matrice); je doprovázen certifikátem osvědčujícím obsah analytu, zjištěný postupem s návaznosti na primární referenční materiál (obvykle referenční metoda s minimální nejistotou)
• pracovní kalibrátor - určen ke kalibraci rutinních metod, jejich hodnoty jsou odvozené od certifikovaných referenčních materiálů, nebo na ně navázaných pracovních kalibrátorů výrobce

Prověření návaznosti metody je nedílnou součástí procesu její validace.

 

Citlivost metody

V praxi rozeznáváme několik charakteristik, které jsou sice označovány jako citlivost ale s různými přívlastky, nebo úzce souvisí se schopností rozlišit od sebe určité úrovně měřené veličiny především v oblasti jejich velmi nízkých hodnot. Rozlišuje se především mezi následujícími pojmy.

Analytická citlivost

Analytickou citlivostí se rozumí podíl změny odezvy měřicího zařízení (výstupního signálu měřicího přístroje) a odpovídající změny podnětu (vstupního signálu, měřené veličiny). Jinými slovy analytická citlivost vypovídá o tom, jak velkou změnu detekované odezvy způsobí změna měřené veličiny.

U lineárních metod je její hodnota konstantní a odpovídá směrnici (sklonu) kalibrační přímky. U metod nelineárních se samozřejmě mění tak jak se mění směrnice kalibrační křivky. Analytická citlivost metody je závislá především na použitém principu detekce odezvy.

Obr. č. 5: Určení analytické citlivosti c_a metody.

Funkční citlivost

Funkční citlivostí metody se rozumí hodnota měřené veličiny (např. koncentrace měřeného analytu ve vzorku), při které je opakovatelnost jejího měření na předem určené hranici (obvykle CV = 20%). Jednoduše se zjišťuje z tzv. profilu preciznosti, tedy závislosti preciznosti metody na  velikosti měřené veličiny (viz Obr. č. 6 ).

Obr. č. 6: Určení funkční citlivosti c_f z profilu preciznosti metody.

 

Mez detekce (L_D- Limit of detection)

je dána nejmenším množstvím analytu ve vzorku, které může být detekováno (odlišitelné od nulové hodnoty), ale které ještě nemusí být stanovitelné jako exaktní hodnota s určitou nejistotou. Tato limitní hodnota od sebe odděluje oblast šumu detekčního zařízení a již detekovatelný signál.

Stanoví se obvykle z údajů měření vzorku s nulovým obsahem měřené veličiny (blank) za podmínek opakovatelnosti (5-10 opakování). Ze získaných hodnot změřené odezvy se spočítá jejich průměr y_B a směrodatná odchylka s_B. Z kalibrační závislosti se potom odečte hodnota měřené veličiny odpovídající signálu:

Mez stanovitelnosti (L_Q- Limit of quantification)

Mez stanovitelnosti naproti tomu určuje takové nejnižší množství analytu ve vzorku (hodnotu měřené veličiny), které může být stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou mírou nejistoty.

Při výpočtu se postupuje obdobně jako v případě L_D, jen koeficient 3 se nahradí číslem 6 nebo 10, podle toho, jaká míra nejistoty resp. hladina spolehlivosti je požadována.  Z kalibrační závislosti se pak rovněž odečte hodnota měřené veličiny, odpovídající spočítané úrovni signálu:

Výsledky měření pod mezí L_D nelze vydávat a výsledky mezi L_D a L_Q lze posuzovat jen jako kvalitativní.  

Obr. č. 7: Určení meze detekovatelnosti a stanovitelnosti

 

Linearita metody

Je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tedy mezi  signálem, tj. měřenou odezvou analytické metody a stanovovanou veličinou. Jinými slovy se jedná o schopnost metody poskytnout detekovanou odezvu měření, která je v daném rozsahu přímo úměrná velikosti stanovované veličiny (např. koncentraci analytu ve vzorku).  Je výhodné, aby metoda fungovala v oblasti lineární kalibrační závislosti, neboť pak je postačují ke konstrukci této závislosti pouze změření dvou bodů, blanku a jednoho kalibrátoru se známou hodnotou měřené veličiny (provádí se dvoubodová kalibrace). Po odečtení signálu blanku je pak přímková kalibrační závislost definovaná prakticky jediným číslem, tj. kalibračním faktorem F, který lze jednoduše stanovit z podílu známé hodnoty měřené veličiny v kalibrátoru x_K a odpovídající velikosti signální odezvy kalibrátoru y_K. Pomocí tohoto faktoru a změřené odezvy vzorku y pak lze  jednoduše určit hodnotu měřené veličiny ve vzorku x.

Pokud má metoda oblast linearity omezenou shora a je zapotřebí analyzovat vzorky s vyšší hodnotou měřené veličiny, pak je nutné volit potřebné ředění vzorku.

 

Pracovní rozsah

Pracovním rozsahem metody se chápe uzavřený interval hodnot měřené veličiny, které lze určit daným měřicím postupem a omezený nejčastěji dolní a horní mezí stanovitelnosti (pokud je nejistota měření v této oblasti přijatelná), nebo rozsahem linearity metody. Viz Obr. č. 8.

V praxi však existuje také řada metod s nelineárním průběhem kalibrační závislosti. V takovém případě samozřejmě nelze vystačit pouze s dvoubodovou kalibrací. Kalibrační křivka se konstruuje obvykle na základě měření alespoň 6 kalibrátorů a výpočet hodnoty zjišťované veličiny neznámého vzorku je v tomto případě podstatně komplikovanější s potřebou využití složitějšího matematického aparátu. Pracovní rozsah metody je pak v horní oblasti kalibrační závislosti omezen jinými limitujícími faktory, v oblasti blízké 0 samozřejmě mezí stanovitelnosti.

Obr. č. 8: Vliv meze stanovitelnosti a linearity na pracovní rozsah metody

 

Analytická specifičnost

Analytickou specifičností se rozumí schopnost měřicího postupu stanovovat pouze tu měřenou veličinu, která má být stanovena.

Analytická specifičnost se obvykle vyjadřuje jako nespecifičnost, tj. jako efekt libovolné složky vzorku odlišné od analytu a způsobující změnu signálu a indikace měřicího přístroje a tím zavádějící systematickou chybu.

Analytická specifičnost metody může být zhoršena například přítomností různých interferentů, tedy složek běžně přítomných v biologické matrici analyzovaných vzorků. Nejčastěji bývají sledovány jako možné zdroje interferencí především vlivy zvýšeného množství triacylglycerolů, bilirubinu nebo hemoglobinu. Podstatně mohou ovlivnit průběh reakcí prováděných v rámci analýzy rovněž léky a jejich působky.

U některých typů metod (např. imunoanalytické metody) se hovoří o tzv. zkřížených reakcích s látkami velmi podobné struktury jako stanovovaný analyt. Obvykle se jedná o různé prekurzory nebo metabolity stanovovaných analytů, agregované molekuly nebo jejich štěpy obsahující shodné aktivní místa nebo antigenní determinanty.

Imunoanalýzy, jakožto metody založené na využití specifických protilátek, mohou být rovněž ovlivněny přítomností různých heterofilních protilátek v analyzovaných vzorcích. Často je zmiňován například vliv tzv. HAMA protilátek (lidské anti-myší protilátky), jejichž výskyt se v populaci zvyšuje. Ovlivnění výsledku měření může být v těchto případech jak směrem pozitivním, tak také negativním.

S vlivem zkříženě reagujících nebo interferujících látek je rovněž spojen příspěvek k nejistotě měření. Díky stanovení obsahu jakéhokoliv ovlivňujícího analytu přítomného v matrici biologického vzorku, dochází ke zvýšení nejistoty měření následkem zvýšení systematické chyby.

Působení zkřížených reakcí či interferencí na výsledky měření se obtížně vyhodnocuje. Byť existují experimentální postupy, v podmínkách rutinních klinických laboratoří jsou téměř nerealizovatelné. Jejich předpokladem je totiž dispozice dostatečného množství jednotlivých potenciálně zkříženě reagujících látek či interferentů. Testování jejich vlivu by mělo být součástí validace metody. Jedním z obvyklých způsobů prezentace těchto informací například bývá uvedení údaje o tom, jaké množství některé ovlivňující veličiny, nezpůsobí odchylku měření větší než 10 %.

 

Výtěžnost (recovery)

Výtěžnost je vlastností metody, která udává její míru schopnosti postihnout měřeným signálem veškerý analyt přítomný ve vzorku a souvisí tak s celkovou pravdivostí metody. Je mírou účinnosti dané metody.

Poukazuje také na případný vliv rozdílů mezi složením vzorků a standardů na výsledky analýzy.

Matematicky je definována jako podíl či procento látky získané za specifikovaných podmínek z celkového množství látky, které by mělo být teoreticky stanoveno. Při relativním vyjádření je zřejmé, že vypočtené hodnoty této charakteristiky by se měly přibližovat 100 %.

kde:
R(a) ... výtěžnost stanovení analytu v dané matrici za specifikovaných podmínek
Q(a) ... množství analytu stanovené analýzou
Q ... skutečné množství analytu v matrici

 

Robustnost metody

Tato vlastnost postihuje schopnost metody poskytovat přijatelné výsledky měření i v případě malých odchylek v měřicím postupu či složení vzorku. Faktorů, které se během realizace metody mohou mírně měnit je celá řada, typicky to mohou být drobná změna teploty nebo reakčního prostředí, změna inkubačních časů, změna operátora apod.  Samozřejmě je cílem, aby analytická metoda na takové drobné odchylky, které mohou v praxi běžně nastat, reagovala minimálně.  

 

Srovnatelnost metody

Obecným požadavkem metod určených pro měření stejné veličiny je jejich vzájemná srovnatelnost. Primárně to je předpokladem shody výsledků získaných různými metodami. Srovnatelnost metody je rovněž důležitá při změně používané metody v laboratoři, kdy je metoda nová porovnávána s metodou stávající. Samozřejmě, že existující diference mohou být zdrojem problémů při interpretaci výsledků.

Pro srovnání výsledků dvou metod se využívají různé postupy regresní analýzy, kdy se vyhodnocují párová data získaná paralelní analýzou souboru vzorků oběma metodami. Výstupem je jednak posouzení lineární regresní závislosti a významnost rozdílů jejich parametrů od optimálních hodnot (úsek přímky blízký 0 a směrnice blízká 1). Společně se provádí i posouzením míry korelace mezi výsledky obou metod (korelační koeficient r by měl optimálně mít hodnotu blízkou 1). Druhou formou výstupu je grafická prezentace srovnání. V grafu se proti sobě vynáší na osu x výsledky získané metodou srovnávací (referenční, původní), na osu y pak výsledky získané metodou srovnávanou (novou) - viz Obr. č. 9.

Obr. č. 9:  Příklad grafického srovnání dvou metod spolu s regresní závislostí.

 

Validace a verifikace metod

Jak již bylo zmíněno v úvodu kapitoly, jsou základní charakteristiky analytické metody prověřovány již ve stadiu jejího vývoje s cílem potvrdit, že metoda splňuje požadavky na účel použití. Tento proces se nazývá validace metody a jeho součástí je rovněž posouzení z hlediska klinického účelu použití. Jedná se tak o proces velmi náročný a složitý, který je předem podrobně naplánován, jeho průběh i výsledky jsou pečlivě zdokumentovány. Výstupem je tzv. validační zpráva jednoznačně uzavírající, zda metoda je pro daný účel použití vhodná.

Z evropské legislativy vyplývá pro výrobce nebo dovozce in vitro diagnostických zdravotnických prostředků (IVD MD) povinnost vybavit tyto prostředky značkou evropské shody CE, ještě před jejich umístěním na evropský trh. Požadavky na proces posouzení shody se sice mohou lišit v závislosti na zařazení diagnostického prostředku do některé z tříd, v každém případě však zahrnují také validaci diagnostika. V současné rutinní praxi laboratoří klinické biochemie převládá trend používání komerčních diagnostických prostředků. Jestliže si analytickou metodu vyvíjí v laboratoři sami, nebo komerčně dodávanou metodu upravují, přenáší se povinnost její validace na pracovníky laboratoře.

V podstatně menším rozsahu je prováděna verifikace metody, jinými slovy pouze prověření zda  diagnostikum splňuje vybrané deklarované vlastnosti i při jeho použití v konkrétní laboratoři. Takto je metoda prověřována nejen před jejím zavedením do praxe a následně také potom ve vhodném časovém intervalu, obvykle 1x za rok. Mezi základní charakteristiky metody prověřované v rámci verifikace patří především prověření opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti metody, včetně odhadu nejistoty.

 

Kontrola kvality

Pojmem kontrola kvality je obecně označován soubor činností realizovaných v laboratoři s cílem zajistit dostatečnou věrohodnost výsledků prováděných měření. Tyto činnosti se dotýkají prakticky jen zajištění analyltické spolehlivosti používaných metod. Podle toho, kdo se na jejich realizaci podílí, se  kontrola kvality dále rozlišuje na:

• vnitřní kontrolu kvality (VKK) - provádí ji pouze personál laboratoře
• externí hodnocením kvality (EHK) - při organizaci a vyhodnocení se uplatňují i vnější subjekty.

 

Vnitřní kontrola kvality

Tento druh kontroly je realizován kontinuálním sledováním mezilehlé preciznosti případně i pravdivosti metody pomocí průběžného měření kontrolních vzorků, které jsou analyzovány v každé sérii stanovení. Znalost cílové hodnoty měřené veličiny v kontrolním vzorku je nutností pouze pro sledování pravdivosti metody. Takovou možnost nabízejí například různé komerčně dodávané kontrolní vzorky s atestem. Jinak lze pro sledování preciznosti využít i vzorky bez atestu a pro sledování pravdivosti zvolit alternativní postup.

Sérií stanovení je myšlena obvykle délka jedné pracovní směny v případě nepřetržitého nebo směnného automatického provozu, nebo jedno stanovení prováděné ve skupině (dávce) vzorků u manuálních metod.

Počet kontrolních vzorků v sérii není striktně definován a odvíjí se od znalosti celkové úrovně kvality dané metody. V praxi se obvykle používají 2-3  vzorky s rozdílnou hodnotou měřené veličiny. Vhodnou volbou je například, aby jeden kontrolní vzorek měl tuto hodnotu uvnitř referenčního intervalu a druhý mimo něj, např. nad jeho horní hranicí.

Výsledky měření kontrolních vzorků jsou posuzovány v souvislosti s výsledky nalezenými dříve. V principu jde o sledování velikosti a charakteru chyb aktuálního měření kontrolního vzorku s cílem identifikovat situace, které jsou z hlediska stanovených požadavků na kvalitu neakceptovatelné a provedením operativního zásahu předejít vydání neadekvátních výsledků.

Nejčastější formou tohoto sledování je jejich vizualizace v podobě grafů tzv. regulačních diagramů. Tento způsob je založen na hodnocení kolísání hodnoty měřené veličiny kolem zvolené - centrální linie diagramu (cílové, deklarované hodnoty veličiny), přípustné rozmezí je dáno intervalem mezi dolní a horní regulační mezí. Těmito mezemi bývá vhodný násobek směrodatné odchylky, odvozené z mezilehlé preciznosti metody dosahované v předchozím období. Příklad regulačního diagramu je uveden na Obr. č. 10.   

Obr. č. 10: Příklad regulačního diagramu bez výskytu podezřelých výsledků

Většinou se do diagramu znázorňují dvě hranice - varovná na úrovni ± 2s a zásahové (regulační) na úrovni ± 3s.  Situace, kdy odchylka výsledku kontrolního měření přesáhne hodnotu 3s se stává signálem k pátrání po možné příčině odchylky a k provedení operativního zásahu s alternativou opakování celé série měření vzorků, která analýze kontrol předcházela.

V regulačním diagramu lze pozorovat i další situace, které mohou vést k nutnosti řešení, například pokud se u výsledků kontrol opakovaně za sebou vyskytuje odchylku od centrální linie stále stejným směrem, nebo mají za sebou získané výsledky shodný trend (viz Obr. č.11).

Obr. č. 11: Regulační diagram s různými typy anomálií

Pro zajištění co největší objektivity při posuzování výsledků vnitřní kontroly byly vyvinuty algoritmy, jejichž cílem je dosažení maximální pravděpodobnosti detekce chyby při minimální pravděpodobnosti falešného zamítnutí série (Wesgardova kombinovaná pravidla). Tyto algoritmy jsou dnes součástí řídících software analyzátorů a bývají rovněž zabudovány i do laboratorních informačních systémů (LIS), čímž přispívají ke zjednodušení hodnocení. Někteří výrobci reagencií nebo komerčních kontrolních vzorků nabízejí rovněž možnost automatického odesílání výsledků kontrolních měření prostřednictvím Internetu do hodnotícího centra, kde jsou vyhodnocovány v kontextu ostatních uživatelů stejných kontrolních materiálů (např. firmy BioRad, nebo Randox apod.) Tento způsob realizace kontroly kvality se již částečně blíží k externímu hodnocení.  

 

Externí hodnocení kvality

Principem EHK (EQA - External Quality Assessment) je hodnocení analytické metody na základě vzájemného porovnáváním výsledků měření dosažených analýzou identických vzorků v různých laboratořích. Toto hodnocení je organizováno a realizováno za předem definovaných a harmonizovaných podmínek (v souladu s platnými normami a podmínkami regionu, v němž jsou prováděny).
Organizaci a hodnocení EHK zajišťuje obecně uznávaný subjekt - poskytovatel EHK. V ČR je takovýmto poskytovatelem pro oblast vyšetření v klinické biochemii firma SEKK s.r.o. Vedle toho však existuje rovněž celá řada zahraničních programů EHK. Vlastní měření je samozřejmě prováděno v účastnící se laboratoři. Kontrolní měření jsou obyčejně zajišťována v rámci různých programů EHK několikrát do roka.

Vlastní realizaci EHK je možno charakterizovat takto:

• Rozeslání identických kontrolních vzorků do laboratoří; vzorky musí být maximálně komutabilní (tzn.  mít vlastnosti obdobné jako vzorky běžně analyzované), musí být dostatečně homogenní a stabilní, tak aby byl zajištěn předpoklad shodných podmínek pro všechny účastníky.
• Účastnické laboratoře provádějí analýzy v rámci konkrétního programu souběžně a jejich výsledky odešlou poskytovateli programu v předem dohodnutém termínu.
• Výsledky jsou poskytovatelem vyhodnoceny podle předem definovaných zásad a kritérií, s nimiž jsou účastníci rovněž předem seznámeni.
• Hodnocení výsledků je sumarizováno do předem dané písemné podoby a rozesláno účastníkům; informace jsou prezentovány jako důvěrné anonymně s kódovanou identifikací jednotlivých účastníků.

Obvykle je v jednom cyklu EHK  rozesíláno několik vzorků (nejčastěji 2 vzorky, existují kontrolní programy, kde je v jednom cyklu rozesíláno např. 5 vzorků). Při hodnocení se posuzuje shoda výsledku účastníka se vztažnou hodnotou (cílovou hodnotou). V závislosti na úrovni návaznosti měření dané veličiny a dostupnosti kontrolního materiálu je možno rozlišit několik typů vztažné hodnoty. Pokud pro měření veličiny existuje referenční metoda, může být vztažnou hodnotou certifikovaná referenční hodnota (CRV). Jiným typem je konsenzus expertů (CVE), což je hodnota získaná měřením ve vybraných expertních laboratořích, nebo konsenzus účastníků (CVP), tedy hodnota vypočtená buďto z výsledků všech účastníků v konkrétním cyklu EHK, nebo z výsledků skupiny účastníků používajících shodný postup měření.   

Pro posouzení shody se vztažnou hodnotou jsou stanoveny maximální toleranční limity, které nesmí být překročeny, pokud má být účastník hodnocen jako úspěšný. Tyto limity vyjadřují přijatelný rozdíl v procentech od vztažné hodnoty D_max (vymezují okolí vztažné hodnoty, ve kterém jsou výsledky považované za přijatelné). S ní je porovnávaná odchylka D_%, která se jednoduše vypočítá jako relativní chyba účastníka z jeho výsledku x a ze vztažné hodnoty X:

Konkrétní výše přípustných odchylek zůstává i přes  snahy o sjednocení u různých poskytovatelů různá. K jejich určení může být aplikován některý z možných přístupů:

• na podkladě biologických rozptylů (při jejich výpočtu se bere v úvahu intra- a interindividuální variabilita měřené veličiny v populaci)
• na základě soudobých analytických možností (např. jako hodnota mezilaboratorní preciznosti dosažená u 20 % nejlepších laboratoří v kontrolním cyklu EHK).

Z limitu platného pro určitý analyt v daném programu EHK lze odvodit rovněž limit pro vnitřní kontrolu, jehož plnění by mělo zaručovat úspěšné hodnocení v rámci EHK. Zjednodušeně by mělo platit, že limit pro vnitřní kontrolu (limit pro přípustnou mezilehlou preciznost metody) by měl být na třetinové úrovni jako limit pro EHK.  

Při hodnocení lze jednoduše posuzovat, zda odchylka laboratoře D_% je menší než D_max. Podmínkou úspěšnosti účastníka v cyklu EHK je, aby podíl obou hodnot, označovaný jako P-skóre, byl v absolutní hodnotě menší než 1, tedy:

V některých programech EHK je pro posouzení úspěšnosti účastníků používán odlišný způsob ohodnocení na základě tzv. z-skóre. V tomto skóre je proměřována odchylka výsledku účastníka x od vztažné hodnoty X a zjištěné mezilaboratorní preciznosti výsledků účastníků cyklu EHK vyjádřené v podobě směrodatné odchylky. Pro úspěšnost účastníka je v tomto případě požadováno, aby absolutní hodnota z byla menší než 3 (hodnota pod 1 je považována za velmi dobrou a pod 2 za akceptovatelnou):

Úspěšná účast laboratoře v programech EHK je známkou kvality její práce a je tak vyžadována orgány prověřujícími funkčnost systému managementu kvality v laboratoři, ale rovněž i plátci zdravotní péče. Vedle tohoto z části represivního charakteru mají programy EHK nezanedbatelný edukativní charakter, který spočívá například v komentování výsledků kontrolních cyklů pověřenými odborníky (supervizory), poskytováním jejich konzultací, publikováním článků v odborných časopisech a pod.

 

Systém managementu kvality v klinických laboratořích

Zodpovědný přístup k zabezpečování kvality práce v klinické laboratoři nelze zjednodušit jen na zajištění kvality vlastního analytického procesu. V souladu s obecnými trendy jsou i v klinických laboratořích zaváděny do praxe komplexní systémy managementu kvality (SMK). Vedle zajištění kvality vlastního měření různých veličin je zdůrazňována potřeba řízení s ohledem na kvalitu všech činností prováděných v laboratoři.

Toto se dotýká nejen vlastního řízení laboratoře včetně zajišťování kvalitních zdrojů (personálu, technického vybavení, prostředí laboratoře a prostředků používaných k provádění analýz), udržování korektních dodavatelsko-odběratelských vztahů a zodpovědného chování vůči odběratelům služeb laboratoře, ale rovněž organizace práce s ohledem na zabezpečování všech pre- a postanalytických požadavků analýz, pořizování a uchovávání informací v rámci laboratorního informačního systému apod.

Předpokladem správné funkce SMK je, aby všechny procesy a činnosti v laboratoři byly zodpovědně popsány a takto zdokumentované následně udržovány v rámci tzv. řízené dokumentace. Tak je docíleno stavu, kdy se v laboratoři vyskytují jen aktuálně platné dokumenty, neaktuální verze jsou archivovány a potřebné záznamy související s činností laboratoře jsou v případě potřeby i zpětně dohledatelné.  Tím, že všichni pracovníci v laboratoři mají pro svou práci k dispozici jednotné a komplexní podklady, je dán zároveň předpoklad maximálního omezení vzniku hrubých chyb pramenících např. z nedokonalého předávání informací.  

Dokumentace SMK má typickou strukturu:

• příručka kvality popisující celý systém,
• směrnice a řády charakterizující základní procesy realizované v laboratoři
• laboratorní příručka, tj. dokument informující především klienty laboratoře o poskytovaných službách a podmínkách jejich poskytování,
• standardní operační postupy popisující provádění jednotlivých analytických metod a obsluhy technických zařízení
• záznamy o používání technických prostředků a záznamy o kvalitě realizovaných měření

 

Certifikace a akreditace

Podobně jako je tomu i v jiných odvětvích, stupňuje se v posledních letech také ve zdravotnictví  tlak na schopnost subjektu prokázat péči o kvalitu své práce. Tyto tlaky mohou být vynucovány jak regulačními mechanismy ve společnosti, tak také mohou být odrazem úsilí subjektu uspět v tržním prostředí, nebo jen dobrovolnou snahou o prezentaci předpokladů pro dosažení odpovídající kvality své práce.

Dnes jsou uplatňovány především dva mezinárodně uznávané a podporované mechanismy k podání důkazu o zavedení fungujícího SMK, resp. o potvrzení způsobilosti určitého subjektu k provádění specifikovaných činností. Prvním z nich je certifikace shody SMK s požadavky stanovenými mezinárodně uznávanou normou. Druhým je akreditace, tedy proces potvrzení způsobilosti určitého subjektu rovněž v souladu s požadavky mezinárodních norem.

Obecné požadavky na funkční SMK jsou shrnuty v normách řady ISO 9000, konkrétně v normě ČSN EN ISO 9001. Tato norma specifikuje požadavky na SMK zavedený u jakéhokoliv subjektu tak, aby byl tento systém správně nastaven a fungující směrem k zajištění kvality činnosti subjektu a její zlepšování. Dneska existuje celá řada certifikačních orgánů, tedy právnických osob, které posuzují shodu SMK žadatele s požadavky zmíněné normy. Rovněž existuje velké množství firem (obecně libovolných organizací a mezi nimi i několik klinických laboratoří), které jsou držitelem takového certifikátu.  Nicméně v ČR v rezortu zdravotnictví a zvláště u zdravotnických laboratoří, není tento způsob příliš preferován.

Konkrétním podmínkám provozu zdravotnických laboratoří lépe odpovídají požadavky specifikované v normě ČSN EN ISO 15189, která je cíleně orientovaná na problematiku práce těchto laboratoří. Proto je dnes v segmentu klinických laboratoří obecně mnohem více uplatňován proces akreditace, tj. potvrzení jejich způsobilosti v souladu s požadavky této normy. Akreditaci provádí na území státu obvykle pouze jeden národní akreditační orgán, v ČR je jím Český institut pro akreditaci, o.p.s.  

Obdobným procesem je rovněž systém provádění prověřování nastaveného systému práce v laboratoři ze strany Národního autorizačního střediska pro klinické laboratoře - NASKL. Tento orgán České lékařské společnosti provádí tzv. edukační audity u laboratoří registrovaných v rámci Registru klinických laboratoří. Během dvou navazujících auditů I a II je v laboratoři prověřováno plnění požadavků specifikovaných v národních akreditačních standardech. Tyto požadavky jsou obsahově velmi podobné požadavkům normy ISO 15189.

Každá z uvedených forem je kontinuálním procesem, který se v čase periodicky opakuje formou reauditů a pravidelných dozorových akcí.

Prokázání péče o kvalitu v laboratoři je v současnosti nutnou podmínkou, kterou si kladou někteří plátci zdravotní péče k tomu, aby uzavřeli s poskytovateli péče smlouvu o jejich úhradách. Například VZP tak uznává pouze jednu z posledních dvou forem, tedy akreditaci ČIA nebo osvědčení o auditu II od NASKL. Tím se požadavek na fungující procesy k zabezpečování kvality v laboratoři dostává na úroveň regulačních mechanizmů a umožňuje tak provozovat činnosti v oblasti poskytování klinických laboratorních služeb prakticky pouze těm laboratořím, které uvedenými procesy úspěšně prošly a disponují požadovanými osvědčeními.

 

LITERATURA

1. Racek, J. Klinická biochemie. Praha : Galén, 2006.
2. Zima, T. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, 2002.
3. Suchánek, M. (ed.) Kvalimetrie 8. Základy metrologie v chemii, Eurachem ČR, 1999
4. Suchánek, M. (ed.) Kvalimetrie 9. Vhodnost analytických metod pro daný účel, Eurachem ČR, 1999
5. Suchánek, M. (ed.) Kvalimetrie 11. Stanovení nejistoty analytického měření, Eurachem ČR, 2001
6. TNI 01 0115:2009. Mezinárodní metrologický slovník - Základní a všeobecné pojmy a přidružené termíny (VIM)
7. ČSN EN ISO 9001:2009 Systémy managementu kvality – Požadavky
8. ČSN EN ISO 15189:2007 Zdravotnické laboratoře - Zvláštní požadavky na kvalitu a způsobilost
9. Metrologická terminologie v klinické a analytické laboratoři (2. přeprac. vydání), SEKK s.r.o. a Eurachem ČR, 2009
10. http://www.sekk.cz/, 30. 9. 2011
11. http://www.naskl.cz/,  30. 9. 2011
12. http://www.cai.cz/, 30. 9. 2011