Metody vyšetřování plazmatických bílkovin

Stanovení koncentrace celkových bílkovin

Pro stanovení koncentrace sérových bílkovin se používá tzv. biuretová reakce, která je v současné době i referenční metodou. Principem je tvorba červenofialového komplexu měďnatých kationtů s dusíkovými atomy peptidových vazeb v alkalickém prostředí. Intenzita zbarvení je úměrná počtu peptidových vazeb a je relativně málo závislá na ostatních vlastnostech jednotlivých bílkovin. Falešně vyšší hodnoty  naměříme u silně lipemických a silně hemolytických sér a při výrazné hyperbilirubinémii; falešně nižší hodnoty u výrazné hyperamonémie (kompetující reakce amoniaku s Cu2+ ionty). Pro stanovení o dva až tři řády nižších koncentrací bílkovin v moči a likvoru nelze tuto metodu použít; zde se využívají turbidimetrické reakce (měření zákalu vzniklého přidáním trichloroctové kyseliny nebo benzethoniumchloridu ke vzorku) nebo vazba různých barviv (pyrogallolová červeň/molybdenan, Coomassie modř)  na bílkoviny vzorku. Tyto metody závisejí již více na vlastnostech měřených bílkovin: vazba barviva na obsahu aromatických aminokyselin, turbidimetrické reakce na tvaru molekuly.

Elektroforéza sérových bílkovin

Metoda využívá rozdílné pohyblivosti bílkovin v elektrickém poli. V prostředí alkalického pufru migrují bílkoviny od katody k anodě. Podle pohyblivosti lze rozlišit pět až šest frakcí: albumin, alfa1, alfa2, beta (často beta1 a beta2) a gama globuliny. Prealbumin migrující ještě rychleji než albumin není normálně patrný.

Obr. č. 1:  Elektroforéza sérových bílkovin. V pozicích č. 3, 11 a 13 je patrný výrazný M-gradient.

Elektroforéza má význam především jako levné screeningové vyšetření pro diagnostiku monoklonálních gamapatií. Poskytuje také celkový přehled o bílkovinném spektru a umožňuje usoudit na přítomnost akutního či chronického zánětu, hepatopatie nebo stavů spojených se ztrátou bílkovin (ledvinami, gastrointestinálním traktem).

Tab. č. 1: Nejčastější abnormity na elektroforeogramu

Některá pracoviště dnes využívají techniky kapilární elektroforézy, při které jsou bílkoviny separovány ve velmi tenkých křemenných kapilárách od anody ke katodě podle své iontové pohyblivosti s využitím elektroosmotického toku a u katody jsou detekovány fotometricky v UV oblasti. Výhodou je možnost statimové analýzy; chybí však možnost přímého vizuálního hodnocení . Záznam elektroforeogramu s patrným M-gradientem (paraproteinem, viz dále v textu) je na obr. 2.

 

Obr.2:  Elektroforeogram: zleva doprava albumin, alfa1, alfa2, beta1, beta2 globuliny, vysoký štíhlý pík paraproteinu (M-gradient) v zóně gama-globulinů.

Pozn.: Ve skutečnosti se elektroforeogram při kapilární elektroforéze “vykresluje” zprava doleva, tj. První jsou v popsaném uspořádání detekovány gama-globuliny a poslední albumin. Zopakujte si principy dělení bílkovin elektroforézou a kapilární elektroforézou (zejm. pojem elektroosmotického toku) a uvědomte si, proč tomu tak je!

Stanovení koncentrace jednotlivých plazmatických bílkovin

Koncentrace specifických proteinů se měří imunochemickými metodami, tj. metodami využívajícími reakce příslušné bílkoviny se specifickou protilátkou. Pro většinu významných plazmatických bílkovin lze použít turbidimetrický nebo nefelometrický princip měření, který z klinických laboratoří zcela vytlačil dříve používanou radiální imunodifúzi. Pro bílkoviny přítomné ve velmi nízkých koncentracích se používají metody se značeným reaktantem (ELISA, RIA, chemiluminiscence, fluorescence). Výjimkou je stanovení albuminu v plazmě, pro které lze využít jednak výpočet z koncentrace celkové bílkoviny a relativního podílu albuminu na elektroforeogramu (ostatní bílkoviny takto stanovit nelze, protože frakce, v nichž na elektroforéze migrují, jsou tvořeny více bílkovinami, které nelze navzájem rozlišit), jednak jednoduchou fotometrickou reakci založenou na vazbě barviv na albumin (bromkresolová zeleň) s následnou změnou jejich absorpčního maxima (komplex BCG-albumin poskytuje výrazné maximum při 630 nm).

Přehled nejdůležitějších plazmatických bílkovin

Existuje více různých hledisek dělení bílkovin. Zvolíme přehled bílkovin podle elektroforetické pohyblivosti, takže se od prealbuminu a albuminu dostaneme přes alfa1, alfa2 a beta globuliny až ke gamaglobulinům, tj. imunoglobulinům. V návaznosti na imunoglobuliny probereme problematiku tzv. monoklonálních gamapatií. Dále uvedeme skupiny bílkovin se společnými znaky, tj. skupinu reaktantů akutní fáze, skupinu nízkomolekulárních bílkovin a skupinu enzymů. Problematika bílkovinných hormonů je probírána v jiné kapitole.

 

Tab. č. 2. Bílkoviny krevního séra – molekulová hmotnost, referenční meze a elektroforetická pohyblivost

Tab. č. 3  Změny koncentrace plazmatických bílkovin u některých patologických stavů

Prealbumin a retinol vázající protein

Prealbumin (transthyretin – může vázat dvě molekuly thyroxinu nebo trijodthyroninu) je tvořen v játrech a v choroidálním plexu mozkových komor. Je částečně asociován s retinol vázajícím proteinem v poměru 1:1. Je to neglykosylovaná tetramerní bílkovina složená ze čtyř identických podjednotek. Pro svůj krátký biologický poločas (48 hodin; retinol vázající protein 12 hodin) je citlivým markerem akutní malnutrice a stavu proteosyntézy.

Pozn.: Jeho stanovení se někdy využívá při výpočtu tzv. Prognostického zánětlivého a nutričního indexu (PINI z angl. Prognostic inflammatory and nutrition index):

PINI = AAG (mg/l)*CRP (mg/l) / albumin(g/l)*PA(mg/l)

Normální hodnoty PINI jsou <1; pacienti s nízkým rizikem mají hodnoty 1-10, se středním rizikem 11-20 a s vysokým rizikem 21-30.

Prealbumin patří k negativním reaktantům akutní fáze (viz níže). Jeho koncentrace klesá při zánětlivých a nádorových onemocněních, u jaterní cirhózy a při ztrátách bílkovin ledvinami nebo gastrointestinálním traktem. Retinol vázající protein je monomerní transportní protein pro all-trans retinol (forma vitaminu A). Je syntetizován v játrech a jeho sekrece z hepatocytu je stimulována vazbou retinolu. Tvorba komplexu s prealbuminem zabraňuje filtraci retinol vázajícího proteinu v glomerulech. Po uvolnění retinolu následuje disociace komplexu prealbuminu a retinol vázajícího proteinu, který je pak eliminován ledvinami. Zvýšené koncentrace retinol vázajícího proteinu nacházíme u pacientů s chronickým renálním onemocněním; snížené koncentrace u jaterních onemocnění a proteinové malnutrice.

Albumin

Je syntetizován výhradně v játrech, která disponují vysokou rezervní kapacitou v případě jeho zvýšené potřeby nebo ztrát.  Jako jeden z mála plazmatických proteinů neobsahuje sacharidy. Při fyziologickém pH má záporný náboj. Pro svou vysokou koncentraci v plazmě se významně podílí na udržování koloidně-osmotického tlaku. Jedná se o kvantitativně nejdůležitější transportní bílkovinu v organismu. Řada látek se v krvi váže na albumin; to je podmíněno přítomností početných nabitých skupin, iontových i hydrofobních specifických vazebných míst. Zejména jde o nerozpustné látky (nekonjugovaný bilirubin, mastné kyseliny, hormony, léky). Hydrofilní látky mohou být na albumin vázány adsorpcí (např. Ca2+, Zn2+, kyselina močová). Transportní funkce albuminu je nespecifická, na rozdíl od specifických transportních bílkovin uvedených níže.  Albumin se dále podílí na antioxidační aktivitě, za patologických stavů působí jako pufr a inhibuje produkci leukotrienů a aktinu. Albumin je negativním reaktantem akutní fáze, jeho koncentrace klesá v přítomnosti prozánětlivých cytokinů (TNF-alfa, IL-1, IL-6).

Alfa-1-globuliny

Alfa-1 lipoprotein (HDL) – viz příslušná kapitola

Orosomukoid (kyselný alfa-1 glykoprotein, AAG)

Je syntetizován převážně v játrech, ale při septických stavech přispívá ke zvýšení plazmatické koncentrace významně syntéza v granulocytech a monocytech. Katabolismus se děje převážně vychytáváním desialovaného AAG jaterními receptory pro asialoglykoproteiny; zatímco biologický poločas intaktního AAG činí asi 3 dny, poločas desialovaného AAG je jen několik minut. AAG patří mezi lipokaliny, tj. bílkoviny vázající lipofilní látky. Jeho funkce není dosud plně známa; předpokládá se i jeho imunomodulační efekt, podmíněný patrně strukturou oligosacharidových řetězců molekuly AAG.

Alfa-1-fetoprotein

Alfa-1-fetoprotein zastává u plodu funkce albuminu, postnatálně je nahrazován albuminem. AFP je významným markerem v prenatální diagnostice (zvýšené koncentrace v amniové tekutině a také v séru matky u defektů neurální trubice,  ale i u vícečetných těhotenství, snížené koncentrace u Downova syndromu – v této indikaci se dnes používá v rámci screeningu vrozených vývojových vad (“screening vvv” v 2.trimestru)  výhradně kombinované stanovení s beta-HCG a popř. ještě nekonjugovaným estriolem v séru matky; tzv. “tripltest”). U netěhotných dospělých je AFP zvýšený u hepatocelulárního karcinomu a nádorů ze zárodečných buněk; může však být zvýšen i u jaterní cirhózy a hepatitidy.

Alfa-1-antitrypsin (Alfa-1-inhibitor proteináz, AAT, alfa-1-Pi)

Alfa-1-antitrypsin je kvantitativně nejvýznamnější inhibitor proteináz v plazmě. Při jeho geneticky podmíněném významném snížení až chybění (genotypy PiZZ a Pi00) dochází k nedostatečné inaktivaci proteas (elastasy v plicních sklípcích) uvolňovaných granulocyty a makrofágy při fagocytóze a proteolytickému rozrušení tkáně. To má za následek plicní emfyzém s poruchou ventilace a sklonem k těžkým infekcím dýchacích cest a často i poškození jater.

Alfa-1-antichymotrypsin

Alfa-1-antichymotrypsin je další proteinázový inhibitor; inhibuje katepsin G, chymasu žírných buněk a PSA (zvýšené koncentrace PSA navázaného na alfa1-antichymotrypsin nacházíme u pacientů s karcinomem prostaty).

Alfa-2 globuliny

Alfa-2 makroglobulin

Alfa2-makroglobulin (AMG) je další z proteinázových inhibitorů.  Je složen ze čtyř polypeptidových řetězců; aktivní jednotkou je dimer (tj. jedna molekula AMG může vázat dvě molekuly proteináz). Je syntetizován převážně hepatocyty. Biologický poločas intaktního proteinu činí několik dnů, ale po rozštěpení nitrořetězcové thioesterové vazby nebo po odštěpení kyseliny sialové je rychle (v řádu minut) vychytáván receptory na hepatocytech. Kromě své hlavní funkce - inhibice proteináz - se AMG účastní transportu řady peptidů (cytokinů, růstových faktorů) a divalentních kationtů (zejména Zn2+) a moduluje zánětlivé reakce.

Zvýšené koncentrace AMG nacházíme u nefrotického syndromu, u dětí jsou koncentrace vyšší než u dospělých a u žen v reprodukčním věku vyšší než u stejně starých mužů (estrogeny zvyšují syntézu AMG). Snížené koncentrace AMG nacházíme u pankreatitidy a u pokročilého karcinomu prostaty (AMG se váže na PSA a tento komplex je velmi rychle vychytáván játry).

Haptoglobin

Váže hemoglobin vzniklý při intravazální hemolýze; vzniklý komplex je rychle z krevního oběhu vychytáván buňkami RES v játrech. Zabraňuje tím ztrátám hemoglobinu (Fe2+) močí a vzniku nebezpečného hydroxylového radikálu, na kterém se podílí volný hemoglobin.

Haptoglobin je citlivým markerem hemolýzy, při níž dochází k výraznému snížení jeho koncentrace až k nulovým hodnotám.  Snížené koncentrace doprovázejí také poruchy proteosyntézy v játrech, u hepatitidy koreluje hladina haptoglobinu s tíží onemocnění. Zvýšené koncentrace nacházíme u reakce akutní fáze.

Ceruloplazmin

Hlavní úlohou ceruloplazminu je ferroxidasová aktivita (oxiduje Fe2+ na Fe3+ a zprostředkuje tak vazbu železa na transferrin). Jedna molekula ceruloplazminu váže 6-8 atomů mědi, ale hlavní transportní bílkovinou pro měď je albumin.

Výrazně snížené koncentrace ceruloplazminu nacházíme u Wilsonovy nemoci (většinou < 0,1 g/l) a Menkesova syndromu. Druhotně mohou být koncentrace ceruloplazminu snížené při ztrátách bílkovin a poruchách jejich syntézy (jaterní cirhóza). Zvýšené koncentrace nemají diagnostický význam; nacházíme je při zánětech a nádorech, v těhotenství nebo při užívání orálních kontraceptiv (vliv estrogenů) a u cholestázy.

Gc-globulin (group specific component, vitamin D vázající protein)

Někdy je označován jako “inter-alfa globulin”, protože může migrovat v alfa1-alfa2 interzóně. Gc globulin je hlavní transportní bílkovinou pro vitamin D; další jeho funkcí je vychytávání aktinu uvolněného z buněk při jejich poškození. Koncentrace Gc globulinu jsou poněkud vyšší u žen než u mužů, stoupají v těhotenství a klesají při akutním jaterním onemocnění a u závažných traumat.

Beta globuliny

Transferrin

Každá molekula transferrinu má dvě vazebná místa pro železitý kation (Fe3+). Apo-transferrin je syntetizován především v játrech, syntéza stoupá při nedostatku železa v organismu. Transferrin je nejdůležitější transportní prostředek pro železo z míst resorpce (tenké střevo) a odbourávání hemoglobinu do krvetvorných orgánů, kde se prostřednictvím receptoru váže na erytroblasty. Při nedostatku železa dochází ke stimulaci syntézy transferinového receptoru a ke zvýšení koncentrace solubilního transferinového receptoru v séru (sTfR – uvolněná extracelulární doména membránového receptoru). Koncentrace sTfR není ovlivněna reakcí akutní fáze, proto je sTfR (popř. poměr koncentrace sTfR k logaritmu koncentrace ferritinu) cenným markerem pro odlišení anémie při deficitu železa od anémie chronických chorob.

Procentuální nasycení transferrinu železem lze vypočítat podle vzorce:

Saturace transferrinu = 3,98 * Železo v séru (mmol/l)/Transferrin v séru (g/l)

Fyziologicky je transferin nasycen železem asi z 1/3, neobsazená místa pro vazbu železa představují tzv. volnou vazebnou kapacitu. (Celková vazebná kapacita transferinu pro železo je dána počtem transferinových molekul, které jsou k dispozici, a skutečností, že jedna molekula transferinu má dvě vazebná místa pro Fe3+.)

Transferin obsahuje 2 N-glykanové řetězce, které se mohou dále větvit; každá větev je zakončena negativně nabitou molekulou kyseliny sialové. Molekula transferinu tak může teoreticky obsahovat 0-8 molekul kyseliny sialové; většina molekul obsahuje 4 (64-80 %) nebo 5 (12-18 %). Izoelektrický bod transferinu s klesajícím počtem molekul kyseliny sialové stoupá. U alkoholiků je nacházena zvýšená koncentrace transferinu s nižším počtem zbytků kyseliny sialové (CDT – carbohydrate-deficient transferrin, tj. disialo-, monosialo- a asialotransferin) a tedy s vyšším pI, čehož lze využít ke sledování těchto pacientů. Izoelektrický bod transferinu však zároveň klesá při vazbě Fe3+, proto je třeba před analýzou CDT transferin “vysytit” železem.

Hemopexin

Hemopexin váže hem. Jeho pokles je méně citlivým (pozdnějším) ukazatelem hemolýzy než haptoglobin. Po vyčerpání kapacity haptoglobinu pro vazbu hemoglobinu cirkuluje zbylý hemoglobin v plazmě; zčásti je pak vychytáván jaterními buňkami, zčásti vylučován močí (hemoglobinurie) a zčásti je oxidován na methemoglobin, z něhož snadno disociuje hem. Hem se může vázat na hemopexin a v této vazbě je transportován k jaterním buňkám. Hem se také může nespecificky vázat na albumin za vzniku methemalbuminu, z něhož může být “předán” opět hemopexinu, jakmile je hemopexin k dispozici.

Koncentrace hemopexinu bývá snížena u hemorhagické pankreatitidy a krvácení do tělesných dutin při současně normálních koncentracích haptoglobinu.

Beta-lipoprotein

Lipoprotein pohybující se v beta2-oblasti odpovídá lipoproteinu o nízké hustotě (LDL). LDL (low density lipoproteins) jsou hlavní lipoproteinové částice, které přenášejí cholesterol v krevní plazmě, s  hustotou 1019 až 1063 kg/m3, tj. 1,019 až 1,063 g/ml, pocházejí z katabolismu IDL a VLDL, a jejich hlavní apoprotein je apo-B-100. Největší část pochází z transformace VLDL, ale některé jsou syntetizovány přímo (zvláště u pacientů s familiární hypercholesterolémií). LDL mohou být katabolizovány různými typy buněk (75% játry), a to jak LDL-receptor dependentním mechanismem, tak mechanismy na těchto receptorech nezávislými (např. pomocí “scavenger” receptorů).

 

C3 a C4 složky komplementu

Komplementový systém se skládá z přibližně 30 bílkovin, které lze rozdělit podle funkce do několika skupin:

1.    Bílkoviny klasické cesty (C1, C4, C2, C3)

2.    Bílkoviny alternativní cesty (C3, faktory B a D, properdin)

3.    Membránu atakující komplex (C5-C9)

4.    Inhibitory uvedených drah

5.    Buněčné receptory

    Hlavními funkcemi komplementového systému jsou:

-          opsonizace (fragment složky C3, označovaný C3b, který se pevně váže na mikrobiální povrch)

-          chemotaxe (fragmenty C3a a C5a)

-          osmotická lýza (komplex C5b-C9, který se zanořuje do plazmatické membrány atakované buňky a vytváří v ní póry (většina mikroorganismů je však vůči tomuto lytickému působení komplementu chráněna buněčnou stěnou)

V klinické praxi se nejčastěji stanovují složky C3 a C4. Jejich koncentrace mírně stoupá při reakci akutní fáze, klesá při jejich aktivaci, resp. spotřebě u některých systémových autoimunitních onemocnění.  C3 složka je v plazmě přítomna v nejvyšší koncentraci ze všech komponent komplementu. Syntezována je převážně v játrech; bakteriální endotoxin indukuje také syntézu v monocytech a fibroblastech. Rovněž C4 složka je syntetizována převážně jaterními buňkami, v malém množství jinými tkáněmi.

Fibrinogen

Fibrinogen je glykoprotein o molekulové hmotnosti 340 kDa. Při elektroforéze se pohybuje mezi beta- a gama-globuliny. Jedná se o symetrický dimer, složený ze tří párů řetězců alfa, beta a gama.

Během hemokoagulace se působením proteolytického enzymu trombinu uvolňuje fibrinopeptid A a vzniká monomer fibrinu. Pak trombin odštěpuje fibrinopeptid B a dojde k polymerizaci monomeru fibrinu, které jsou příčně pospojovány aktivovaným koagulačním faktorem XIII za vzniku stabilního trombu.

Patří mezi pozitivní reaktanty akutní fáze zánětu. Jeho hladina stoupá během několika hodin po vzniku zánětu navozením zvýšené syntézy v játrech a během několika dní může dosáhnout několikanásobku vstupní hladiny. Vysoké koncentrace nacházíme např. u zánětlivých chorob pojiva. Fibrinogen představuje rizikový faktor aterosklerózy.

Pokles koncentrace může být způsoben nedostatečnou syntézou u těžkých hepatopatií nebo zvýšenou spotřebou, např. při diseminované intravaskulární koagulopatii (DIC).

Na elektroforeogramu nacházíme fibrinogen v beta-gama interzóně. Může být zaměněn za M gradient (a naopak), což je hlavní důvod, proč při elektroforéze dáváme přednost séru před plazmou.

Gama globuliny

Imunoglobuliny

Imunoglobuliny (protilátky) rozpoznávají antigen a iniciují mechanismy jeho zničení. Všechny imunoglobulinové molekuly se skládají ze dvou identických těžkých (H z angl. heavy) řetězců (alfa u IgA, delta u IgD, gama u IgG, mí u IgM, epsílon u IgE) a dvou identických lehkých (L z angl. light) řetězců (kappa nebo lambda). Každý z řetězců má konstantní část a část variabilní, která se účastní na rozpoznání a vazbě antigenu. Variabilní část těžkého i lehkého řetězce je tvořena jedinou doménou; konstantní část lehkého řetězce je tvořena rovněž jedinou doménou, ale konstantní část těžkého řetězce je tvořena více doménami. Lehký řetězec spolu s variabilní částí a první doménou konstantní části těžkého řetězce tvoří tzv. Fab fragment (ab znamená “antigen binding”, tj. fragment vázající antigen); další domény konstantních částí těžkých řetězců tvoří tzv. Fc fragment (c zde znamená crystallizable, tj. krystalizovatelný). Každá molekula imunoglobulinu má tedy dva Fab fragmenty a jediný Fc fragment. Na rozdíl od většiny plazmatických bílkovin, které jsou syntetizovány v játrech, jsou imunoglobuliny syntetizovány a secernovány plazmatickými buňkami.

Imunoglobuliny jsou glykoproteiny; oligosacharid je vždy vázán na konstantní část těžkého řetězce (na řetězec gama se váže jeden oligosacharid, na ostatní typy H řetězců více molekul oligosacharidů).

Obr. č. 3:  Nejjednodušší schématické znázornění molekuly imunoglobulinu sestávající se dvou těžkých (H) řetězců a dvou lehkých (L) řetězců. Lehké řetězce mají variabilní (V) část a konstantní (C) část přibližně stejné velikosti, zatímco u těžkých řetězců představuje variabilní část jen asi jednu čtvrtinu a konstantní část (C1-C3) asi tři čtvrtiny velikosti. Čárky mezi řetězci znázorňují disulfidové vazby. Nejsou znázorněny vnitrořetězcové disulfidové vazby. Počet disulfidových vazeb v pantové oblasti (spojující oba těžké řetězce) je u různých tříd a podtříd imunoglobulinů odlišný.

Imunoglobulin G (IgG)

Je kvantitativně nejvíce zastoupen (70 – 75 % celkových imunoglobulinů). 65 % IgG je přítomno extravaskulárně. Hlavní funkcí IgG je neutralizace toxinů ve tkáních. IgG obsahuje jednu molekulu oligosacharidu zakončenou glukosaminem (GlcN), vázanou N-glykosidickou vazbou na asparagin v konstantní části těžkého řetězce. IgG se dělí do několika podtříd (IgG1 – IgG4), které se liší zejména uspořádáním pantové oblasti.

Imunoglobulin M (IgM)

IgM je první imunoglobulin syntetizovaný v průběhu protilátkové odpovědi a také jediný imunoglobulin normálně syntetizovaný již u novorozenců. Existuje jako monomer vázaný na membránu, zatímco většina IgM přítomného v séru je pentamerem složeným z pěti monomerních imunoglobulinových jednotek spojených malým glykopeptidem, tzv. J řetězcem. IgM obsahuje asi 10 % sacharidů. Jeho velká molekulová hmotnost (M.r.900 000 pro pentamer) zabraňuje jeho úniku do extravaskulárních prostor.  IgM účinně aktivuje komplement; tato funkce je zajištěna Fc částí molekuly.

Imunoglobulin A (IgA)

Představuje 10 až 15 % sérových imunoglobulinů. Obsahuje 10 % sacharidů, biologický poločas je asi 6 dní. Většina IgA je přítomna jako monomer, ale 10 až 15 % sérového IgA je dimerem. Dimer je více odolný vůči destrukci patogenními mikroorganismy. Jinou formou IgA je tzv. sekreční IgA, přítomný v slzách, slinách, potu, mléce, kolostru a v sekretech dýchacích cest a trávicího traktu. Sekreční IgA má M.r. 380 000 a je složen ze dvou monomerních IgA jednotek, sekreční komponenty (M.r. 70 000) a J řetězce (M.r. 15 600). Je syntetizován hlavně plazmocyty ve sliznicích střeva a bronchů a ve vývodech mléčné žlázy. Sekreční komponenta uděluje sekrečnímu IgA zvýšenou rezistenci k enzymům, což umožňuje ochranu sliznic před mikroorganismy. Jeho přítomnost v kolostru a mléce chrání novorozence před střevními infekcemi.

Imunoglobulin D (IgD)

Představuje méně než 1 % sérových imunoglobulinů. Je to monomer obsahující 12 % sacharidů, M.r. 184 000. Je přítomen jako membránový receptor pro antigen na B lymfocytech.

Imunoglobulin E (IgE)

IgE obsahuje 15 % sacharidů, M.r. 188 000. IgE molekuly se váží na povrch žírných buněk (svou Fc oblastí). Dojde-li k vazbě antigenu (alergenu) a spojení dvou takto navázaných IgE molekul, žírné buňky jsou stimulovány k uvolnění histaminu a dalších vazoaktivních látek zodpovědných za projevy alergických reakcí.

 

U novorozenců a kojenců se setkáváme s fyziologickou, přechodnou hypogamaglobulinémií (viz obr. 4). K setrvale nízkým až nulovým hodnotám imunoglobulinů vedou protilátkové imunodeficience; postiženy mohou být buď imunoglobuliny všech izotypů (např. Brutonova agamaglobulinémie vázaná na X chromozóm), nebo jen některých (např. běžná variabilní imunodeficience s poruchou tvorby protilátek IgG a IgA nebo selektivní deficit IgA, který je u nás nejčastějším protilátkovým imunodeficitem). Častější než tyto primární imunodeficience jsou ovšem protilátkové imunodeficience sekundární (získané), např. při střevních zánětech, nefrotickém syndromu, dlouhodobé imunosupresívní nebo cytostatické léčbě a při malignitách postihujících B-lymfocyty.

Obr. č. 4. Schématické znázornění změn koncentrací imunoglobulinů v prvních měsících života. Transplacentárně přenesené IgG protilátky (mIgG) klesají v prvním roce života k nulovým hodnotám; nejnižší koncentrace celkového IgG je mezi 3.-6. měsícem. Koncentrace IgA dosahuje hodnot dospělých až kolem 10. roku věku.

Volné lehké řetězce kappa a lambda

Lehké řetězce jsou součástí molekuly imunoglobulinů; fyziologicky jsou však produkovány v mírném nadbytku nad řetězci těžkými a jsou proto nacházeny i v krevním séru. Zdá se, že mají určitý význam v regulaci imunitní odpovědi. Při nádorových proliferacích vycházejících z plazmatických buněk můžeme najít v krevním séru výrazně (až o několik řádů) zvýšené koncentrace volných lehkých řetězců jednoho typu; kromě absolutních koncentrací sledujeme také poměr (free kappa/free lambda) nebo nověji také rozdíl (diferenci) jejich koncentrací (free kappa – free lambda nebo naopak). Jejich stanovení vyžaduje použití protilátky specifické proti tzv. skrytým determinantám, tj. determinantám “neviditelným”, je-li lehký řetězec vázán na těžký řetězec v kompletní imunogloublinové molekule. Problematika imunochemického stanovení volných lehkých řetězců je proto značně specifická a není dosud zcela uspokojivě vyřešena; přesto jsou cenným markerem v diagnostice i sledování pacientů s monoklonálními gamapatiemi, ale také perspektivním markerem aktivity některých autoimunitních onemocnění (systémový lupus erythematosus, revmatoidní arthritida, Sjögrenův syndrom aj.).

Monoklonální gamapatie

Termín označuje přítomnost imunoglobulinů (popř. jejich fragmentů) produkovaných jedním klonem plazmatických buněk. Podle mezinárodní klasifikace z r. 2003 sem patří následující stavy:

1.    Monoklonální gamapatie nejistého významu (MGUS z angl. monoclonal gammopathy of undetermined significance)

2.    Asymptomatický (doutnající) mnohočetný myelom (ASMM)

3.    Symptomatický mnohočetný myelom

4.    Solitární kostní plazmocytom

5.    Extramedulární plazmocytom

6.    Vícečetný solitární plazmocytom

7.    Plazmocelulární leukémie

Vzácně nacházíme monoklonální imunoglobuliny i u nenádorových onemocnění (AIDS, chronická hepatitida, cirhóza, revmatoidní arthritida aj.); v části případů jde pravděpodobně o koincidenci s MGUS.

Screeningovým testem pro diagnostiku monoklonálních gamapatií je elektroforéza sérových bílkovin. Při nálezu monoklonálního (M) gradientu se doplňuje imunofixační elektroforéza, kdy je M gradient typizován (IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, popř. free kappa, free lambda, IgD a IgE). Monoklonální gamapatie ve třídě IgM doprovází onemocnění zvané Waldenströmova makroglobulinémie. Při imunofixaci zde může docházet k vazbě ostatních imunoglobulinů na molekuly monoklonálního IgM a “falešné” pozitivitě v ostatních třídách. Situaci lze elegantně řešit přidáním malého množství merkaptoethanolu nebo dithiothreitolu (viz obr. 5a-c).

Obr.č.5a

Obr.č.5b

   

Obr.č.5c

Obr. č. 5:    Imunofixační elektroforéza.

ELP: elektroforéza
G, A, M, K, L: Imunofixace antiséry proti řetězcům gamma, alfa, mí, kappa, lambda.
a) paraprotein IgG kappa
b) paraprotein IgG lambda
c) paraprotein IgM kappa patrný až po inkubaci vzorku s dithiothreitolem; ve vzorku bez dithiothreitolu je “falešná” pozitivita ve všech pozicích

   

Při nálezu paraproteinu určujeme jeho kvantitu denzitometricky a při prvním vyšetření doplníme imunofixaci k určení typu těžkého a lehkého řetězce; zpráva laboratoře ošetřujícímu lékaři pak vypadá např. “paraprotein IgG kappa, denzitometricky 30 g/l”. Při dalším sledování pacientů již znovu imunofixaci neprovádíme, dokud je paraprotein denzitometricky kvantifikovatelný. Při použití moderních léčebných metod paraprotein často vymizí; v okamžiku, kdy již není kvantifikovatelný, je indikována opět imunofixace. Po transplantaci kmenových buněk dochází někdy k oligoklonální odpovědi (několik proužků detekovatelných na elektroforéze, popř. jen při imunofixaci; mohou náležet různým třídám lehkých i těžkých řetězců); ta neznamená relaps onemocnění, nýbrž přechodnou dysregulaci produkce imunoglobulinů po transplantaci.

Kryoglobulinémie

Kryoglobuliny jsou imunoglobuliny reverzibilně precipitující při teplotách nižších než je teplota lidského těla. Dělíme je do 3 typů:

I. typ: izolované monoklonální kryoglobuliny (paraproteiny IgM, vzácněji IgG, IgA nebo monoklonální lehké řetězce)

II. typ: smíšené kryoglobuliny (kombinace paraproteinu s polyklonálním imunoglobulinem, obvykle paraprotein IgM s protilátkovou aktivitou proti polyklonálním IgG)

III. typ: polyklonální imunoglobuliny, kdy je kryoglobulin tvořen imunoglobuliny jedné nebo více tříd tvořícími antigen-protilátkový komplex

Kryoglobulinémie ovlivňuje řadu laboratorních vyšetření (mj. zpomaluje sedimentaci), na všechna vyšetření by měl být vzorek séra nebo plazmy předehříván; někdy se doporučuje před elektroforézou inkubace séra s merkaptoethanolem nebo dithiothreitolem.

Ještě vzácnější než kryoglobuliny jsou tzv. pyroglobuliny – monoklonální imunoglobuliny ireverzibilně precipitující při teplotě 56°C.

Polyklonální gamapatie

Zvýšené koncentrace polyklonálních imunoglobulinů (t.j. homogenní zvýšení gama-globulinů při ELFO) nacházíme u onemocnění pojiva (systémový lupus erythematosus, Sjögrenův syndrom, revmatoidní arthritida aj.), jater (autoimunitní i virové hepatitidy, primární  biliární cirhóza, primární sklerozující cholangoitida, hemochromatóza, alkoholické poškození jater, deficit a1-antitrypsinu), chronických infekcí, lymfoproliferativních onemocnění i nehematologických malignit. Onemocnění kůže, plic a střev, a také některé jaterní nemoci, jsou často provázeny zvýšenou koncentrací IgA, zatímco systémové infekce vedou ke zvýšeným koncentracím všech imunoglobulinů, zejm. IgG.

Reaktanty akutní fáze

Označujeme tak bílkoviny, jejichž koncentrace v plazmě se mění při akutním zánětlivém postižení. Dělíme je na pozitivní (CRP, SAA a další), jejichž koncentrace za těchto okolností stoupá, a negativní (prealbumin, albumin, transferrin), jejichž koncentrace v séru naopak klesá.

C-reaktivní protein (CRP)

Název této bílkoviny je odvozen od schopnosti vázat C-polysacharid buněčné stěny Streptococcus pneumoniae. Váže však různé polysacharidy na površích baktérií, hub a prvoků, ale také fosfatidylcholiny a polyanionty. Po vazbě dochází k aktivaci komplementu klasickou cestou. Hlavní úlohou CRP je rozpoznání potenciálně toxických látek uvolněných z poškozených tkání.

CRP je nejvýznamnějším pozitivním reaktantem akutní fáze vzhledem ke snadné dostupnosti jeho stanovení a rychlému vzestupu koncentrace (do 24-48 hodin). Jeho koncentrace stoupají u bakteriálních infekcí, ale také po infarktu myokardu, traumatech, chirurgických výkonech a při nádorových onemocněních.

Sérový amyloid A (SAA)

Je protein o celkové M.h. 220 000 – 235 000, složený z monomerů o M.h. 12500. Většinou je navázán na HDL lipoproteiny. Jde o skupinu malých lipoproteinů, které při akutní infekci vychytávají lipidové zbytky buněčných membrán a má tak pozitivní účinek; naopak u chronických zánětů může prekurzorový protein SAA  vytvářet nerozpustná depozita v orgánech a podílet se tak na vzniku sekundární amyloidózy (na rozdíl od ní jde u primární amyloidózy o depozita lehkých řetězců imunoglobulinů při maligním myelomu a příbuzných onemocněních). Sérová koncentrace SAA je zvýšená  rovněž u některých maligních nádorů a stoupá s progresí onemocnění.

Prokalcitonin (PCT)

Prokalcitonin se zvyšuje v plazmě při bakteriálních infekcích, při sepsi a multiorgánovém selhání. Hlavním stimulem jsou bakteriální endotoxiny. Zvýšení v plazmě nastává po 2 hodinách, jasně zvýšené koncentrace jsou 6 – 8 hodin a zůstávají zvýšené po dobu 72 hodin.

Ferritin

Ferritin je především zásobní bílkovinou pro železo; jedna molekula apoferritinu může vázat až 4500 atomů železa (Fe3+). Protože je současně pozitivním reaktantem akutní fáze, je zmíněn na tomto místě.

Některé nízkomolekulární bílkoviny

Nyní probereme stručně některé významnější nízkomolekulární bílkoviny. Obecným znakem nízkomolekulárních bílkovin je vzestup sérové koncentrace při poklesu glomerulární filtrace, uplatňují se tedy jako markery renálního onemocnění a jako takové jsou probrány v příslušné kapitole. Zde zmíníme nejvýznamnější z nich:

Beta-2-mikroglobulin

Beta-2–mikroglobulin je jednoduchý neglykosylovaný polypeptid tvořený 100 aminokyselinami s jedním disulfidickým můstkem o molekulové hmotnosti 11 800 Da. Je součástí HLA systému na povrchu buněk. Plazmatický beta-2-mikroglobulin je produktem hlavně myeloidních a lymfoidních buněk a dá se užít jako tumorový marker, odrážející proliferaci buněk tohoto původu.

Volně prochází plně funkčním glomerulem. V moči roste jeho hladina při lézi tubulárních buněk, hladina v séru stoupá s poklesem glomerulární filtrace. Dlouhodobě zvýšená koncentrace beta-2-mikroglobulinu v séru, např. u dialyzovaných pacientů, může být příčinnou sekundární amyloidózy.

Cystatin C

Cystatin C je protein z rodiny inhibitorů cysteinových proteáz, filtrovaný glomeruly a plně reabsorbovaný tubuly ledvin, vhodný pro posuzování glomerulární filtrace. Cystatiny mají evoluční a funkční vztah k serinovým proteázovým inhibitorům. Cystatin C, který je především předmětem zájmu klinických biochemiků, patří do cystatinové rodiny II., která je tvořena skupinou extracelulárních inhibitorů cysteinových proteáz. Jednotliví zástupci této skupiny se označují pořadovými čísly, ačkoli třetí cystatin se i nadále nazývá cystatin C.

 

Beta-trace protein

Je enzym konvertující PGH2 na PGD2 (prostaglandin-H2 D-isomerasa) o M.h. 25 kDa. Jeho původ je výhradně mozkový, hlavním místem syntézy je choriodální plexus a leptomeningy. Odtud je BTP uvolňován do likvoru. BTP je přítomen ve stopách i v jiných tělních tekutinách včetně séra. Jeho koncentrace v likvoru je 32x vyšší než v séru. Je tedy výborným markerem likvorey. Vedle uplatnění v likvorologické diagnostice se někdy používá jako marker glomerulární filtrace (podobně jako cystatin C). Nevýhodou je vysoká cena stanovení.

Cytokiny

Termín “cytokin” označuje signální látku celulárního původu. Cytokiny jsou nízkomolekulární bílkoviny (často glykosylované) produkované buňkami imunitního systému (lymfocyty, monocyty, makrofágy, neutrofilní granulocyty) i buňkami v klasickém pojetí “neimunitními” (endotel, fibroblasty aj.). Vyznačují se převážným působením na buňky, které je vytvářejí a na buňky v blízkém okolí (autokrinní a parakrinní působení). Působí ve velmi nízkých koncentracích, jejich poločas je velmi krátký (minuty).

Interleukin 6 (IL-6)

Při akutním zánětu stoupá již za 2-4 hodiny, nezávisle na funkci jater. Proto je vhodný zejména k časné diagnostice. Koncentrace IL-6 v plazmě nebo séru zdravých osob je <11,3 ng/l; koncentrace >400 ng/l budí naléhavé podezření na sepsi. Senzitivita testu je téměř stoprocentní; specificita závisí na základním onemocnění. Zvýšené koncentrace mohou být u autoimunitních onemocnění, glomerulonefritidy, nádorů a v prvních dnech po chirurgcikém výkonu.

Interleukin 8 (IL-8)

Má podobný význam jako IL-6. Zvýšené koncentrace nacházíme u akutního zánětu, ale také při tkáňové hypoxii a traumatech.

Tumor nekrotizující faktor (TNF-a)

Je považován za marker syndromu systémové zánětlivé odpovědi (SIRS – “systemic inflammatory response syndrom”). Stanovení je však problematické. TNF-a je po stimulaci secernován jen několik hodin a jeho poločas je <5 minut. Je třeba rozlišovat mezi testy stanovujícími biologicky aktivní TNF-a (trimer) a testy stanovujícími “celkový” TNF-a (detekuje i monomery a štěpné produkty).

Současné zvýšení koncentrací IL-8 a TNF-a svědčí pro aktivaci monocytů (SIRS). Je-li zvýšen jen IL-8, svědčí to pro aktivaci neimunitních buněk, např. po vazbě baktérií nebo jejich lipopolysacharidu na endotelové buňky.

Nevýhodou je vysoká cena stanovení cytokinů, z nichž pouze stanovení IL-6 jako časného markeru akutního zánětu doznalo širšího použití.

Literatura

Bradwell A. R. Serum Free Light Chain Analaysis (plus Hevylite). 6. vydání. The Binding Site Group Ltd., Birmingham, 2010.
Burtis C. A., Ashwood E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3rd Edition. W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1999.
Dörner K. Klinische Chemie und Hämatologie. 6. aktualizované vydání. Thieme, Stuttgart, 2006.
Hořejší V, Bartůňková J. Základy imunologie. 3. vydání, Triton, Praha, 2005.
Racek J. a kol. Klinická biochemie. 2. vydání. Galén, Praha, 2006.
Tichý M. Laboratorní analýza monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů). A.L.Instruments, Český Těšín, 1997.
Zima T. a kol. Lagoratorní diagnostika. 2. vydání. Galén, Praha, 2007.
Kolektiv autorů (editoři A. Jabor, M. Zámečník, L. Straka): Encyklopedie laboratorní medicíny. http://www.enclabmed.cz/encyklopedie