Vyšetření mozkomíšního moku

Cytologie mozkomíšního moku

Kvantitativní stanovení počtu elementů v mozkomíšním moku se provádí ve Fuchs-Rosenthalově komůrce. V nativním preparátu se stanoví počet erytrocytů, po obarvení kyselým fuchsinem se znázorní jádra leukocytů, které se rovněž spočítají. Za normální nález se považuje 0-3 elementy/μl. Objem komůrky je 3,2 μl, proto se zjištěný celkový počet buněk dělí třemi.

Obr. 1 Fuchs-Rosenthalova komůrka

 

Obr. 2 Nebarvený (nativní – vlevo) a barvený (vpravo) likvor ve Fuchs-Rosenthalově komůrce

 

Morfologická diferenciace leukocytů na mononukleáry a polynukleáry je ve Fuchs-Rosenthalově komůrce málo spolehlivá. K přesnější diferenciaci elementů je potřeba zhotovit trvalý cytologický preparát. Základní barvicí metodou je barvení podle Pappenheima. Trvalý cytologický preparát se připraví cytosedimentační nebo šetrnou cytocentrifugační metodou.

Preparát slouží k cytologické diagnostice, umožňuje hodnocení zastoupení jednotlivých buněčných typů a určení jejich funkčního stavu.

Fyziologicky jsou přítomny v likvoru pouze mononukleáry, převažují elementy klidové. Patologický je výskyt erytrocytů, polynukleárů (výjimkou je arteficiální příměs krve či novorozenecký likvor), plasmocytů a fagocytů.

 

Typy buněk v mozkomíšním moku

Lymfocyt

Klidový lymfocyt je buňka o velikosti 8-10μm, má úzký plazmatický lem a kompaktní jádro, které vyplňuje téměř celou buňku. Tyto buňky najdeme v normálním mozkomíšním moku. Lymfoidní buňky se po setkání s antigenem transformují a jejich vzhled se mění. Aktivovaný lymfocyt (reaktivní) je lymfoidní buňka 11-18 μm s výraznou bazofilní cytoplazmou a s velkým jádrem. Vývojová řada T-lymfocytů končí u lymfoidních buněk, v plasmocyty se vyvíjejí pouze B-lymfocyty.T-lymfocyty jsou odpovědné za cytolýzu a aktivaci makrofágů. Plasmocyty jsou největší lymfoidní buňky o velikosti až 21 μm s bazofilní plazmou. Kulaté nebo oválné jádro s patrnými jadérky bývá uloženo excentricky.Typické je perinukleární projasnění plazmy.

Obr.

 

Plazmocyt

Plazmocyty jsou konečným stadiem B-lymfocytů po imunologické stimulaci a produkují imunoglobuliny. Vyskytují se patologicky v mozkomíšním moku, nejčastěji u pacientů se záněty virového původu.

 

Monocyt

Monocyty jsou buňky velké 15-30 μm. Jádro mívá nepravidelný tvar, nejčastěji podkovy nebo fazole. Plazma se barví světleji než u lymfocytů. Jsou to buňky morfologicky velmi proměnlivé. Aktivované monocyty se odlišují od klidových větší velikostí a vakualizovanou plazmou. Jsou schopny fagocytózy jiných buněk nebo nebuněčných částic. Aktivované monocyty s pohlceným materiálem se nazývají makrofágy. Podle fagocytovaného materiálu lze rozlišit různé typy, např. erytrofágy, hemosiderofágy, lipofágy apod. Monocyty jsou součástí normálního buněčného obrazu, aktivované monocyty nebo makrofágy však svědčí pro patologický děj.

 

Obr.

 

Neutrofilní polymorfonukleár

Neutrofilní polynukleáry jsou buňky o velikosti 10 -15 μm. Za normálních okolností se vyskytují v mozkomíšním moku pouze ve zralé, segmentované podobě. Charakteristická morfologie s děleným jádrem a granuly v plazmě odpovídá krevním neutrofilům. V mozkomíšním moku jsou z granulocytární řady leukocytů nejčastější a provázejí akutní záněty nervového systému, zejména záněty bakteriální. Granulocyty mají také schopnost fagocytózy, pohlcují např. bakterie. Nejsou však schopny fagocytovat jiné leukocyty nebo erytrocyty. Eosinofilní granulocyty jsou o něco větší než neutrofily. Jádro bývá nejčastěji rozděleno na dvě části a v plazmě je množství načervenalých granulí. V mozkomíšním moku jsou spíše vzácným nálezem – jejich výskyt může svědčit pro chronicitu procesu, dále je můžeme vidět u parazitárních onemocnění.

Obr.

 

Nádorové buňky

Nádorové buňky v mozkomíšním moku mnohem častěji pochází z extrakraniálních nádorů než intrakraniálních. Cytologické vyšetření mozkomíšního moku a pátrání po nádorových buňkách je významné zejména u pacientů s metastatickými tumory, u leukémií, lymfomů, primárních mozkových nádorů a u meningeálního dráždění neznámého původu. Mezi všeobecně uznávaná kritéria malignity buněk patří vysoký nukleoplazmový posun ve prospěch jádra, velká jadérka, časté dělení buněk, značná velikost buněk, tendence k buněčným shlukům.

Obr.

 

Typy cytologických likvorových nálezů

Podle početně převažující řady dělíme pleocytózu nebo patologickou oligocytózu na granulocytární, lymfocytární, monocytární nebo tumorózní.

 

Granulocytární pleocytóza s převahou neutrofilů se vyskytuje u hnisavých zánětů, výskyt eosinofilů je častý u onemocnění parazitárních, mykotických nebo u chronických patologických procesů.

Obr.

 

Granulocytární oligocytóza je častá v počáteční fázi nehnisavých zánětů nebo mozkové ischémie.

 

Lymfocytární pleocytóza se vyskytuje u nehnisavých zánětlivých onemocnění (infekce virové, dále infekce způsobené borreliemi, leptospirami nebo bacily tuberkulózy)

Obr. x větší buňky se světlejším jádrem jsou aktivované lymfocyty

 

Lymfocytární oligocytóza se často nachází u roztroušené sklerózy.

Monocytární pleocytóza nebo oligocytóza s nálezem aktivovaných monocytů je nespecifickým nálezem charakteristickým pro neinfekční onemocnění – kompresivní syndrom, autoimunitní onemocnění. Nález je také charakteristický pro konečnou fázi zánětu.

 

Tumorózní pleocytóza nebo oligocytóza svědčí pro maligní onemocnění.

Obr.

 

Normální cytologický nález v likvoru je oligocytóza (počet buněk do 3-5/μl), jsou přítomny lymfocyty, monocyty, aktivované formy do 10 %.

 

Biochemické vyšetření mozkomíšního moku

 

Vzhled likvoru

• čirý a bezbarvý (normální nález)

• sangvinolentní (s příměsí krve) vzniká patologickou nebo arteficiální příměsí krve.

• xantochromní (nažloutlý) může být známkou staršího krvácení do likvorových cest nebo se vyskytuje při těžké poruše hematolikvorové bariéry.

• zkalený nacházíme u purulentních meningitid.

 

Celková bílkovina - hladina celkové bílkoviny je za normálního stavu asi 200x nižší než v séru. Za normálních okolností je 80 % celkové bílkoviny sérového původu, zbývajících 20 % je mozkového původu. Fyziologická hodnota celkové bílkoviny je při lumbální punkci 0.15-0.40 g/l. V mozkových komorách je hodnota celkové bílkoviny výrazně nižší. Novorozenci mají v likvoru vyšší hodnotu celkové bílkoviny pro nezralost hematolikvorové bariéry. Nejvyšší podíl v zastoupení celkové bílkoviny má albumin, v likvorovém prostoru jsou modifikovány dále některé sérové proteiny – např. prealbumin, transferin. Imunoglobuliny přestupují do likvoru z krve nebo vznikají intratékální syntézou v likvorových prostorách. K zánětlivým markerům dále patří haptoglobin, C-reaktivní protein, C3 a C4 složky komplementu, antitrombin III a α1-antitrypsin. K tumorovým markerům řadíme orosomukoid.

Klinický význam má zvýšení celkové bilkoviny, které nastává u zánětů (u bakteriálních zánětů výrazné zvýšení až na desítky gramů), poruchách cirkulace likvoru – např. výhřezu meziobratlové ploténky nebo u intratékální syntézy imunoglobulinů při aktivaci imunitního systému .

Glukóza je základním energetickým zdrojem pro nervovou tkáň, hladina glukózy v likvoru závisí na hladině glukózy v séru, tvoří asi 60 % sérové hodnoty. Vyšší výpovědní hodnotu má poměr CSF glukóza/S glukóza, který je za normálních poměrů 0,6. Klinický význam má snížení hladiny glukózy v likvoru nebo poměru glukózy v likvoru a séru. Doprovází bakteriální záněty, nádorové meningeální infiltrace, subarachnoideální krvácení.

Laktát – hladina laktátu v likvoru nezávisí na plazmatické koncentraci, laktát prakticky neprochází přes hematolikvorovou bariéru. Fyziologická hodnota laktátu je 1,2 – 2,1 mmol/l. Laktát vzniká při metabolismu glukózy bez přístupu kyslíku, klinický význam má jeho zvýšená hladina. Ke zvýšení dochází u zánětů, lehké zvýšení doprovází virové nebo tuberkulosní meningitidy. Výrazné zvýšení nastává u bakteriálních zánětů. Diskriminační hodnota pro rozlišení typu meningitidy je asi 4 mmol/l. Koncentrace laktátu bývá zvýšena u ischemických vaskulárních lézí .

Chloridy – fyziologická hladina je 120-132 mmol/l, od jejich stanovení se upouští. Ke snížení chloridů dochází u výraznějších poruch hematolikvorové bariéry zejména u specifických zánětů jako je tuberkulózní meningitis.

Albumin je syntetizován v játrech, do likvoru se dostává jedině přestupem přes hematolikvorovou bariéru. Slouží k posouzení funkčnosti této bariéry. Pro vyhodnocení poruchy funkce hematolikvorové bariéry má koncentrační kvocient CSF/sérum albumin vyšší senzitivitu než absolutní koncentrace albuminu v likvoru.

Z koncentrace albuminu v likvoru a séru vypočítáváme tzv. albuminový kvocient Qalb.= CSFalb./Salb. Hodnoty albuminového kvocientu závisí nejen na „propustnosti“ (permeabilitě) bariéry v užším slova smyslu, ale i na obratu (cirkulaci) likvoru. Je výrazně vyšší u novorozenců. Normální hodnota Qalb je do 7,4 .10-3; přesněji vzato závisí poněkud na věku podle rovnice Qalb. ≤ 4 + (věk v letech/15). Mírně porušenou bariéru nacházíme u chronických neuroinfekcí nebo roztroušené sklerózy. Střední poruchu bariéry můžeme vidět např. u virových infekcí a těžká porucha bariéry je typická pro bakteriální meningitidy, polyradikuloneuritidu Guillain-Barrého typu, maligní meningeální infiltraci nebo herpetickou encefalitidu.

Imunoglobuliny – zdrojem imunoglobulinů je buď sérum, odkud přecházejí při poruše bariéry, nebo intratékální syntéza v likvorovém prostoru při onemocnění CNS spojeném s imunitní reakcí.

 

Vyšetření intratékální syntézy imunoglobulinů

Intratékální syntéza protilátek v centrálním nervovém systému pochází z perivaskulárních infiltrátů lymfocytů B, které lokálně proliferují , dozrávají v plazmocyty a produkují příslušné protilátky. Na rozdíl od známé a charakteristické reakce v séru, kde dochází k přechodu z protilátkové tvorby ve třídě IgM do třídy IgG v subakutní nebo chronické fázi nemoci, není takový přechod v intratékální syntéze přítomen. Tvorba protilátek ve třídě IgG/IgM/IgA je přítomna již na počátku onemocnění a zůstává relativně konstantní. Intratékální protilátková odpověď nemusí znamenat vždy akutní onemocnění, ale může být přítomna u zánětlivého onemocnění CNS, které se manifestuje zvýšeným počtem buněk v likvoru, dále u zbytkové intratékální syntézy po proběhlém onemocnění nebo u chronického zánětlivého autoimunitního procesu v CNS. Moderní likvorová diagnostika roztroušené sklerózy je dnes založena především na průkazu intratékální syntézy imunoglobulinů.

 

Kvantitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů

Zvýšení koncentrace imunoglobulinů v likvoru může být důsledkem jejich zvýšené koncentrace v séru, poruchy hematolikvorové bariéry nebo obou těchto faktorů. Dominantním transportním mechanismem přes hematolikvorovou bariéru je difúze proteinů ze séra do likvoru. Dle fyzikálních zákonů difúze prostupují větší molekuly pomaleji (např. IgM) než menší molekuly (např. IgG a albumin). Důsledkem zvýšení koncentrace určitého sérového proteinu je zvýšení koncentrace téhož proteinu v likvoru, avšak gradient vyjádřený poměrem koncentrace proteinu v likvoru a séru zůstává konstantní. Při porušené hematolikvorové bariéře dochází k patologickému zvýšení koncentrace proteinu v likvoru, proto je třeba stanovit albumin a příslušné imunoglobuliny současně v séru i v likvoru. Pro klinickou diagnostiku má nejvyšší význam stanovení intratékální syntézy IgG, IgM a IgA. K průkazu intratékální syntézy imunoglobulinů se v současné době doporučuje používat rovnici dle Reibera, která popisuje vztah mezi Q albuminu a Q příslušného imunoglobulinu. Tento vztah není lineární, ale hyperbolický. Hranice mezi lokální syntézou imunoglobulinů a jejich pasivním přestupem je znázorněna modrou čárou. Hodnoty nad touto linií znamenají intratékální syntézu a rozsah je vyznačen přerušovanou čárou a vyjádřen v procentech. Vertikální přerušovaná čára odděluje normální a porušenou hematolikvorovou bariéru.

Obr. x Reibrův diagram

 

Interpretace patologických nálezů s ohledem na funkci hematolikvorové bariéry a intratékální syntézu:

• Oblast 1 – normální nález

• Oblast 2 – porucha funkce HLB bez intratékální syntézy

• Oblast 3 – porucha funkce HLB s intratékální syntézou imunoglobulinů

• Oblast 4 – intratékální syntéza se zachováním funkce HLB

• Oblast 5 – oblast analytických chyb

 

Z diagnostického hlediska lze na základě přítomnosti intratékální syntézy jednotlivých imunoglobulinů rozlišovat stavy

• Bez průkazu intratékální syntézy Ig: časná bakteriální a virová meningitida, Guillainův-Barrého syndrom

• Intratékální syntéza s převahou IgG: roztroušená skleróza, neurolues, chronická HIV encefalitida.

• Intratékální syntéza s převahou IgA: neurotuberkulóza, mozkový absces

• Intratékální syntéza s převahou IgM:neuroborrelióza

 

Kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů

Kvalitativní průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů spočívá ve stanovení oligoklonality imunoglobulinů pomocí izoelektrické fokusace (IEF). Současně je analogickým způsobem vyšetřeno sérum naředěné na koncentraci odpovídající mozkomíšnímu moku. Pro intratékální syntézu svědčí průkaz dvou a více oligoklonálních pásů v likvoru, které nemají analogii v séru. Metoda izoelektrické fokuzace slouží k rozdělení látek amfoterní povahy (mají kyselé i bazické skupiny) a dělí se v gradientu pH podle svého izoelektrického bodu. Na základě mezinárodního konsensu je stanoveno pět typů rozdělení při IEF likvoru a séra.

 

1. typ: normální stav bez průkazu oligoklonálních pásů (OP)

2. typ: OP v likvoru, které nejsou v séru (zejména u roztroušené sklerózy)

3. typ: OP v obou materiálech a navíc OP přítomné v likvoru (neuroborrelióza,mozkomíšní skleróza)

4. typ: identické OP v likvoru a séru (paraneoplastické syndromy,SLE)

5. typ: monoklonální pásy v likvoru a séru (monoklonální gamapatie)

Obr.

 

Základní typy rozdělení při IEF

U pacientů s diagnózou roztroušené sklerózy je stanovení oligoklonálních pásů pozitivní až v 98%. Oligoklonální pásy nacházíme i u infekčních procesů, u autoimunitních nebo systémových onemocněních. Významné výsledky v likvorové diagnostice roztroušené sklerózy přineslo zavedení specifické reakce MZR (morbilli, rubeola a varicella zoster), která umožňuje detekovat některá chronická onemocnění CNS již v době prvních klinických příznaků. Jako reakce MZR se označuje intratékální syntéza specifických protilátek třídy IgG proti neurotropním virům spalniček, zarděnek a planých neštovic.Přítomnost reakce MZR je vysvětlována moderní teorií imunitní sítě, ve které každá imunologická reakce indukovaná konkrétním antigenem postihuje celou imunitní síť.Kromě specifických protilátek proti vyvolávajícímu agens je zvýšena produkce mnoha dalších protilátek a autoprotilátek – tzv. polyspecifická imunitní odpověď. Koncentrace jednotlivých specifických protilátek v likvoru a séru jsou měřeny a jejich poměr se vztahuje k poměru „celkových“ protilátek téže třídy jako tzv. protilátkový index (AI). Hodnoty nad 1,4 jsou patologické a indikují intratékální syntézu specifických protilátek.Reakce MZR je specifická pro chronická autoimunitní zánětlivá onemocnění nervového systému, především pro roztroušenou sklerózu.

 

Spektrofotometrie likvoru

Provádí se při podezření na intermeningeální krvácení. Je přínosné v časných stadiích, kdy ještě nejsou změny v cytologickém obrazu. Spektrofotometrie je 10x citlivější než lidské oko, pozitivní nález můžeme získat i u napohled bezbarvého likvoru. Provádí se registrací absorbance v oblasti viditelného světla (380 – 700 nm), detekuje se přítomnost oxyhemoglobinu a bilirubinu.

Nález oxyhemoglobinu může značit čerstvé krvácení – objevuje se za 4-8 hod po začátku krvácení. Maximum absorbance má při 415 nm, 2 minoritní vrcholy jsou při 540nm a 580 nm. U bilirubinu je maxima dosaženo 3. den po začátku krvácení, přetrvává 3 týdny, maximum absorbance je při 450 nm.

 

Mikrobiologické vyšetření a detekce patogenních agens

Mezi základní postupy patří kultivace se stanovením citlivosti, mikroskopické a bakteriologické vyšetření nátěru. Specifické protilátky se vyšetřují v séru i v likvoru, prokazuje se jejich intratékální syntéza. Specifickou a velmi citlivou metodu představuje polymerázová řetězová reakce (PCR) pro průkaz detekce DNA patogenních agens (nejčastěji se používá pro stanovení borrelií a herpetických virů).

 

Perspektivy vývoje likvorologického vyšetření

V současnosti se obrací zájem k novým možnostem v diagnostice degenerativních a metabolických onemocnění centrálního nervového systému a také prionových infekcí. Zatím se jedná spíše o experimentální výzkum. Např. pro diagnostiku Creutzfeldtovy-Jakobovy choroby svědčí zvýšená koncentrace 14-3-3 proteinu v likvoru, který je v současné době považován v likvoru za obecný marker značné tkáňové destrukce. Likvorová diagnostika Alzheimerovy choroby se opírá o stanovení β-amyloidu,τ-proteinu a fosfo- τ-proteinu. Protein β-amyloid je součástí amyloidových plak, které se akumulují v mozku. Protein τ se vyskytuje v cytoskeletu CNS. U Alzheimerovy choroby se nachází snížené hodnoty β-amyloidu a zvýšené hodnoty τ-proteinu.Dále se hodnotí jejich vzájemný poměr, index τ/ β-amyloid, který bývá zvýšený. Dalším parametrem, který může přispět k diagnostice neurodegenerativních onemocnění, je cystatin C. Cystatin C patří mezi inhibitory cysteinových proteáz, v systémovém oběhu je poměrně stabilní a v klinické praxi je znám jako ukazatel odhadu glomerulární filtrace.U pacientů s neurodegenerativními chorobami CNS nacházíme zvýšené hodnoty cystatinu C v likvoru . Strukturální protein S-100 patří do rodiny proteinů vážících vápník. Zvýšená hodnota S100 (S100B) je známkou strukturálního postižení tkáně CNS; protein S100 (S100B) lze měřit i v séru za účelem odhadu prognózy a monitorování stavu pacienta bez nutnosti lumbální punkce. β2 mikroglobulin patří k proteinům, které jsou přítomny ve všech tělních tekutinách.Vzestup jeho koncentrace v likvoru nacházíme u stavů obecně spojených s aktivací a zmnožením lymfocytárních a makrofagických elementů. U pacientů s roztroušenou sklerózou byla zkoumána přítomnost neuronálních protilátek – v likvoru byly nalezeny protilátky proti molekulám myelinového obalu. Jde především o myelinový bazický protein (MBP) ze skupiny strukturálních proteinů, který je základem myelinu. Protilátky proti MBP odrážejí míru myelinové destrukce.

 

Průkaz likvorey

Někdy je důležité určit, zda u pacienta po úrazu hlavy je sekret vytékající z nosu jen zánětlivý exsudát z nosní sliznice nebo mozkomíšní mok. V tomto případě se jedná o závažný stav s komunikací likvorových cest a nosní dutiny, ohrožující pacienta přestupem bakteriální flóry na meningy. Detekce likvoru je možná stanovením parametru specifického pro likvor. K dispozici je stanovení beta trace proteinu – enzymu, který je syntetizován v buňkách chorioideálního plexu. V likvoru se nachází v koncentracích 20-30x vyšších než v séru. Dalším parametrem je β2 transferin. Ze sérového transferinu se v likvorových prostorách odštěpí zbytky kyseliny sialové (mozkovou neuraminidázou), vzniká asialotransferin, který lze detekovat pomocí elektroforézy s imunofixací v β2 zóně globulinů.

 

 

 

Literatura:

http://www.wikiskripta.eu/index.php/Mozkom%C3%AD%C5%A1n%C3%AD_mok

http://www.skolio.cz/main/clanek.php?id=104

http://www.wikiskripta.eu/images/7/79/Reiber%C5%AFv_diagram.png

 

KALA, Miroslav; MAREŠ, Jan. Lumbální punkce a mozkomíšní mok. první. Praha : Galén, 2008. 137 s. ISBN 978-80-7262-568-0.

ADAM, Pavel, et al. Proteinologie mozkomíšního moku. Praha : Medica News Publishers,s.r.o,, 2002. 123 s. ISBN 80-86284-22-0.

GLOSOVÁ, L. Cytologický atlas mozkomíšního moku. 1. vydání. Praha : Galén, 1998. ISBN80-85824-70-1

RACEK, J, et al. Klinická biochemie. První vydání. Praha : Galén – Karolinum, 1999. ISBN