Úvod

Výsledky laboratorních vyšetření jsou bezesporu velmi důležitým zdrojem informací pro volbu správné léčby pacienta. Mimo jiné přispívají k určení nebo upřesnění diagnózy, volbě a optimalizaci postupu terapie nebo k jeho sledování, případně ke stanovení prognózy stavu pacienta.

Při interpretaci získaných výsledků je ve většině těchto případů posuzováno, nakolik se tento výsledek shoduje s hodnotami, které lze odůvodněně předpokládat u zvolené srovnávací, tj. referenční populace. Jinými slovy je konkrétně získaný výsledek porovnáván s mezemi ohraničujícími interval hodnot výsledků, jež byly získány provedením stejného laboratorního vyšetření na vzorku referenční populace, neboli s referenčním intervalem.

 

1. Základní pojmy a definice

Referenční interval: obecně přijímanou definicí tohoto pojmu je určení hranic, mezi nimiž se nachází 95 % referenčních hodnot (v případě některých parametrů bývá používán interval zahrnující až 99%).

Obvykle se ale jedná o interval mezi dolní a horní referenční mezí, za které jsou nejčastěji považovány 2,5 a 97,5 percentil souboru hodnot získaných analýzou dostatečně homogenního a početného vzorku definované referenční populace.

Z klinického hlediska může být v některých případech důležitá pouze horní nebo dolní referenční mez, což pak odpovídá 95 percentilu resp. 5 percentilu.

Příklady některých konkrétních veličin s jejich přiřazením k typu referenčního intervalu je uveden níže (Tab. č. 1).

Referenční hodnoty: jsou hodnoty (výsledky měření odpovídající veličiny) získané u vybrané skupiny jedinců s definovaným stavem zdraví.

Rozložení referenčních hodnot: distribuce jednotlivých výsledků měření, odpovídající některému ze statistických rozdělení. Typ odpovídajícího rozdělení (např. normální, neboli Gaussovo, log-normální, Laplaceovo apod.) je testován vhodnými statistickými metodami.

Referenční populace: množina všech jedinců splňujících určité předpoklady, jednak týkající se jejich zdravotního stavu, případně další definované požadavky (věk, pohlaví, rasa). Obvykle je požadována nepřítomnost určité nemoci, přičemž je jasné, že takto definovaný pojem „zdraví“ je značně relativní a svým způsobem nedokonalý.

Referenční jedinec: jedinec vybraný z množiny referenční populace.

Výběr referenční populace (výběrová referenční skupina): náhodně vybraná část referenční populace, u které jsou měřením získány výběrové referenční hodnoty, z nichž je dále proveden odhad referenčních mezí. Reálně nelze měření provádět u celé referenční populace ale jen u vhodně zvoleného náhodného výběru. Výběrové charakteristiky získané měřením u tohoto výběru jsou pak více či méně věrohodným odhadem skutečnosti.

Věrohodnost odhadu: tj. shoda mezi odhadem a skutečnou hodnotou charakteristickou pro celou populaci. Závisí na celé řadě skutečností, především na velikosti výběru referenční populace. Obvykle je minimálně požadováno alespoň 120 referenčních jedinců - interval spolehlivosti odhadů charakteristik se podstatně zužuje v závislosti na velikostí výběrové referenční skupiny. Na věrohodnost odhadu mají dále vliv preanalytické aspekty (způsob odběru, transportu a uchovávání vzorků), metoda měření a použitý způsob statistického vyhodnocení.

Tab. č. 1: Příklady typů referenčních intervalů v závislosti na klinickém významu referenčních mezí (DRM - dolní mez, HRM – horní mez)

Typ referenčního intervalu	Měřená veličina (parametr)
DRM – HRM	Na+, K+, Ca2+, glukóza, transferin, hormony štítné žlázy
pod HRM	bilirubin, AST, ALT, CK, troponin I, nádorové markery
nad DRM	CHS, prealbumin

Obr. č. 1: Souvislosti mezi jednotlivými pojmy souvisejícími s určením referenčního intervalu

 

2. Možnosti určení referenčního intervalu

Pro určení referenčních intervalů z reálných výsledků měření se obvykle volí jeden ze dvou metod.

První, označovaná jako přímá (induktivní) metoda odhadu referenčních mezí, se aplikuje v případě, kdy existuje možnost získání dostatečně velké referenční výběrové populace, u které je při splnění odpovídajících preanalytických podmínek provedeno měření sledované veličiny. Volba požadavků na referenční jedince, je poměrně problematická záležitost a může zásadně ovlivnit výsledné hodnoty referenčních mezí. V rámci studie NORIP (Malmø, 27/4-2004) byly navrženy některé z těchto požadavků společně s preanalytickými podmínkami, které by měly být během určování referenčních intervalů dodržovány. Mimo jiné je žádoucí, aby referenční jedinec splňoval tyto podmínky:

• cítit se subjektivně dobře,
• stáří více než 18 let,
• vyloučit těhotné a kojící ženy,
• v posledních měsících nebyl hospitalizován nebo vážně nemocen,
• konzumace alkoholu nepřesahující 24 g / za posledních 24 hodin,
• během posledních 5 měsíců nedarovat krev,
• poslední 2 týdny neužívat léky,
• nekouřit v posledních hodinách před odběrem.

Druhá metoda označovaná také jako nepřímá (deduktivní) metoda je aplikována v případě, kdy není vhodná referenční výběrová populace k dispozici a je možno využít pouze výsledky dané veličiny získané měřením u tzv. smíšené populace, zahrnující zdravé i nemocné jedince.

 

2.1 Přímá metoda odhadu referenčního intervalu

Tato metoda je založena na statistickém zpracování naměřených referenčních hodnot. Data získaná měřením lze vyhodnotit buďto parametrickým nebo neparametrickým způsobem v závislosti na tom, zda jsou pro určení referenčních mezí využívány parametry charakterizující rozdělení referenčních hodnot a pomocí nich jsou pak odvozeny numerické hodnoty odpovídajících kvantilů určujících referenční meze. Neparametrický postup je sice univerzálnější, ale věrohodnost odhadů kvantilů je v tomto případě menší.

 

2.1.1 Parametrický postup

Parametrický postup lze oprávněně použít pouze u výběrů pocházejících z normálního (Gaussova) rozdělení, nebo z rozdělení, která je možno na normální transformovat. Pouze v těchto případech lze totiž použít parametry tohoto rozdělení, kterými jsou výběrový průměr a výběrová směrodatná odchylka, jako nejlepší odhady charakteristik polohy a rozptylu tohoto rozdělení a z nich odvodit hodnoty odpovídajících percentilů.

Důležitým krokem pro volbu metody odhadu referenčních mezí je potvrzení předpokladu normality rozdělení získaných referenčních hodnot s primárním požadavkem na symetrii rozdělení. Pro posouzení normality jsou používány různé statistické testy (například Kolmogorov-Smirnovův, Anderson-Darlingův, D’Agostino-Pearsonův). Přitom je třeba mít na zřeteli, že různé statistické testy mohou mít různou vypovídací schopnost, takže mohou spíše informovat, že s předpokládanou normalitou rozdělení není něco v pořádku. S výhodou jsou tyto testy často používány v kombinaci s grafickými metodami, které umožňují porovnat distribuci změřených referenčních hodnot (znázorňovaných obvykle v podobě histogramu) s normálním rozdělením o shodných parametrech pomocí grafu frekvenční funkce (hustoty pravděpodobnosti). Běžné statistické programy umožňují také z množiny získaných referenčních hodnot konstruovat tzv. rankitové grafy a pomocí nich porovnat kvantily výběrového rozdělení s kvantily normálního rozdělení. V případě shody výběrového rozdělení s rozdělením normálním má tato závislost přímkový charakter.

Obr. č. 2: Histogram rozdělení získaných referenčních hodnot (osa x: hodnota měřené veličiny,  osa y: četnost výskytu) a jeho aproximace frekvenční funkcí o stejných parametrech a rankitový graf porovnání kvantilů empirického rozdělení (osa y) s kvantily normálního rozdělení (osa x)

Aby byl odhad parametrů nevychýlený, je zapotřebí otestovat, zda referenční hodnoty získané měřením neobsahují odlehlé výsledky případně hrubé chyby. K tomu účelu je možno využít některý z obvyklých testů odlehlých hodnot (Grubbsův test, Dean-Dixonův test apod.), nebo se i v tomto případě dají využít některé grafické metody. Pokud se v datech odlehlé výsledky nebo hrubé chyby vyskytují, je dalším krokem jejich vyloučení.

Normální rozdělení je jednoznačně charakterizováno svými parametry, tj. průměrem µ a rozptylem σ². Z dat výběrového souboru lze určit pouze odhady těchto parametrů, kterými jsou výběrový průměr x a výběrový rozptyl s². Oba parametry lze vypočítat podle následujících vztahů:

Z hodnoty rozptylu se pak prostým odmocněním vypočítá výběrová směrodatná odchylka s.  Na základě znalosti těchto parametrů lze pak jednoduše odhadnout 2,5 a 97,5 percentil. Za předpokladu normálního rozdělení totiž platí, že tyto kvantily lze vypočítat jako

x_(2,5) = x - 1,96 s

x_(97,5) = x + 1,96 s

Pro normální rozdělení obecně platí, že celková plocha pod křivkou hustoty je rovna 1 a pravděpodobnost, že náhodná veličina nabude hodnot z určitého intervalu, je rovna ploše vymezené pod křivkou hustoty nad tímto intervalem.

Například pro interval s hranicemi < μ - 1,96 σ;  μ +1,96 σ > má tato plocha velikost právě 0,95.

Obr. č. 3: Graf hustoty pravděpodobnosti náhodné veličiny X s normálním rozdělením N(µ,σ²), znázorňující míru pravděpodobnosti výskytu hodnoty veličiny v intervalech µ -1,96σ až µ+1,96σ

V praxi se koeficient 1,96 často zaokrouhluje na hodnotu 2, takže meze referenčního intervalu jsou potom jednodušeji určovány jako  x ± 2 s.

Pro případ určení referenčního intervalu s mírou pokrytí větší pravděpodobnosti než 95 %, lze použít koeficienty s vyšší hodnotou. Například koeficient 2,57 odpovídá pravděpodobnosti 99 %.  

Podmínku normálního rozdělení splňuje v praxi jen omezená množina biologicky významných veličin. Tento typ rozdělení lze očekávat pouze u analytů s relativně úzkou biologickou distribucí, jako například při měření koncentrace iontů v séru (Na⁺, K⁺, Cl^-, Ca²⁺ aj.).

Většinou se však v praxi setkáváme s veličinami, které mají distribucí hodnot nesymetrickou,  sešikmenou směrem k vyšším hodnotám. Příkladem mohou být veličiny jako koncentrace glukózy, kreatininu, močoviny, enzymů AST, ALT, CK, tyreotropního hormonu apod.

Obr. č. 4: Graf hustoty pravděpodobnosti náhodné veličiny X s nesymetrickým rozdělením sešikmeným vpravo

Takto sešikmená nesymetrická distribuce se často modeluje pomocí tzv. log-normálního rozdělení, které lze jednoduše převést na rozdělení normální pomocí logaritmické transformace prostým logaritmováním naměřených hodnot. Pokud není tato transformace dostatečně účinná, lze použít jinou (například mocninnou, nebo Box-Coxovu transformaci).

Pro určení referenčního intervalu se pak již postupuje obdobně jako u výběru z normálního rozdělení: tzn. že se u transformovaných dat ověří jejich normalita, provede se odhad výběrových parametrů (transformovaného průměru a směrodatné odchylky) a pomocí nich se vypočítají transformované referenční meze DRM_T a HRM_T:

DRM_T = x_T - 1,96 · s_T

HRM_T = x_T + 1,96 · s_T

Pomocí inverzní funkce k použité transformaci se z nich poté určí meze referenčního intervalu. Například v případě použití logaritmické transformace se provede odlogaritmování vypočítaných hodnot mezí (exp - inverzní funkce k funkci log).

DRM  =  exp(DRM_T)

HRM =  exp(HRM_T)

 

2.1.2 Neparametrický postup

Primárně je používán tehdy, pokud je k dispozici dostatečně velká výběrová referenční skupina. Současně tento způsob postupu určení mezí referenčního intervalu je postupem obecnějším a nejsou u něj kladeny požadavky na rozdělení dat.

V tomto případě se k určení referenčních mezí přistupuje následujícím způsobem:

• změřená data jsou vzestupně seřazena podle své velikosti
• každé hodnotě je postupně přiřazeno pořadové číslo od 1 do N tak, že minimální hodnota má číslo 1 a maximální hodnota má číslo N
• určí se pořadová čísla prvků v seřazeném souboru určující 2,5 a 97,5 percentil - n_(2,5) a n_(97,5)
• DRM se přiřadí hodnota prvku odpovídajícího pořadovému číslu 2,5 percentilu a HRM se přiřadí hodnota prvku odpovídajícího pořadovému číslu 97,5 percentilu (pokud některé z čísel n_(2,5) nebo n_(97,5) není celé, získá se hodnota referenční meze provedením lineární interpolace mezi hodnotami prvků s pořadovými čísly oboustranně nejbližšími tomuto číslu)
• za střední hodnotu referenčního intervalu je považován medián výběru referenčních hodnot

Pro určení pořadového čísla odpovídajících percentilů je možno postupovat následujícím způsobem (doporučení IFCC):

n_(2,5)  = 0,025 · (N + 1)

n_(97,5) = 0,975 · (N + 1)

nebo alternativně podle doporučení Linneta (Linnet K., Clin Chem 2000,46, 867-9):

n_(2,5)  = 0,025 · N + 0,5

n_(97,5) = 0,975 · N + 0,5

Obr. č. 5: Vzestupné setřídění výběru referenčních hodnot podle jejich velikosti

2.1.3 Vydatnost odhadů referenčních mezí

Vzhledem k tomu, že pracujeme pouze s výběrovou referenční populací, jsou jakýmkoliv použitým postupem získány vždy pouze odhady referenčních mezí a nikoliv jejich skutečné hodnoty.  Mírou věrohodnosti těchto odhadů může být např. velikost jejich 90% konfidenčního intervalu. Ta úzce souvisí s rozsahem výběrové referenční populace, tedy s počtem referenčních jedinců, kteří byli do výběru zahrnuti.

Při použití neparametrického postupu jsou konfidenční intervaly obecně širší než v případě použití postupu parametrického. Pro dosažení srovnatelné úrovně věrohodnosti obou postupů by bylo zapotřebí, aby byl v případě neparametrického postupu rozsah výběru přibližně dvojnásobný než v případě postupu parametrického. Je třeba poznamenat, že existuje možnost zlepšení vydatnosti neparametrického postupu, resp. dosažení stejné kvality při rozsahu výběru menším o cca 5-15 %. Tento postup je označován jako princip „bootstrap“. Při něm je opakovaně realizován výše uvedený neparametrický postup, vždy však na podmnožině referenčních hodnot (o rozsahu n) náhodně vybrané z celé výběrové populace o původním rozsahu N. Počet opakování je například k=100. Z každého opakování je získána konkrétní dvojice mezí - dolní DRMi a horní HRMi.  Za výsledný odhad dolní referenční meze je považován průměr všech dílčích dolních mezí a obdobně dílčích horních mezí pro odhad horní referenční meze.

 

2.2 Nepřímá metoda odhadu referenčního intervalu

Tento způsob odhadu mezí referenčního intervalu je možno použít v případě, kdy neexistuje reálná možnost získání dostatečně početné a reprezentativní referenční výběrové populace, ale z praxe jsou k dispozici výsledky měření dané veličiny získané v běžném rutinním provozu laboratoře. Požadavkem je, aby pro tuto metodu bylo k dispozici poměrně velké množství dat, řádově tisíce. Na jedné straně se sice jedná o data získaná u tzv. smíšené populace zahrnující zdravé i nemocné jedince bez možnosti splnění předem definovaných požadavků na její výběr. Na straně druhé je to však populace reálně vyšetřovaných jedinců, umožňujících při dostatečně velkém rozsahu provádět i jejich stratifikaci například podle věku nebo pohlaví.

Zpracování reálných výsledků měření vychází z předpokladu, že v dostatečně velkém výběru existuje podstatně vyšší podíl zdravých jedinců než osob nemocných a při volbě vhodného způsobu zhodnocení výsledků budou získané odhady mezí referenčního intervalu odpovídat zdravé populaci. Referenční intervaly získané touto metodou však budou širší než v případě metody přímé s možným  posunem směrem k hodnotám typickým pro populaci nemocných. Navíc při použití této metody nelze objektivně odhadnout typ rozdělení hustoty pravděpodobnosti u zdravé populace.

Schematický princip metody (dle Baadenhuijssena):

1. sestrojení histogramu (cca 50 tříd, min.1200 hodnot)
2. vyhlazení dat pomocí filtru (Golay-Savicky)
3. vynesení derivace logaritmů frekvence naměřených hodnot proti koncentraci
4. výpočet úseku (a) a směrnice (b) přímky proložené v lineární části závislosti
5. μ = a/b;  σ = -1/b
6. referenční meze RM = μ ± 1.96 σ

 

3. Význam referenčního intervalu při interpretaci výsledků

Referenční interval je v praxi využíván při interpretaci výsledků měření tím, že vymezuje hranice „normálního“ nálezu, tedy rozsah, ve kterém by měl ležet výsledek zdravého jedince. Pro snadnější poskytnutí této informace jsou výsledkové zprávy z laboratoří vedle numerického výsledku často doplněny také grafickým znázorněním polohy výsledku vzhledem k referenčním mezím. Obvykle se však jedná pouze o schematické vyobrazení skutečnosti, zda se výsledek měření nachází uvnitř referenčního intervalu nebo mimo něj (např. polohou znaku * = výsledek, uvnitř nebo vně závorek = referenční interval). Bylo by však podstatnou chybou, pokud by lékař situaci, kdy se výsledek měření nachází mimo meze referenčního intervalu, automaticky interpretoval jako patologický nález bez ohledu na to, jak daleko je výsledek vzdálen od referenční meze.   

Při posuzování výsledků laboratorního vyšetření vzhledem k referenčnímu intervalu si je třeba uvědomit, že referenční interval je konstruován pomocí odhadů jeho mezí. To znamená, že charakter těchto mezí není bodový, ale ve skutečnosti je intervalový a existuje tak pro každou mez konfidenční interval vyjadřující oblast, kde se skutečná mez s určitou mírou pravděpodobnosti nachází.

Především je nutné přistupovat opatrně k interpretaci těch výsledků, které se nacházejí v blízkosti referenčních mezí bez ohledu na to, zda uvnitř nebo vně referenčního intervalu. V těchto hraničních situacích se navíc uplatňuje i nejistota výsledku měření, tedy atribut vlastní každé analytické metodě. Díky nejistotě tak je třeba i změřený výsledek chápat nikoliv jako bod odpovídající jeho hodnotě, ale rovněž jako interval, ve kterém se výsledek měření nachází s 95% pravděpodobností.

Z uvedených skutečností pak vyplývá, že v těchto případech může existovat nenulová pravděpodobnost,  že výsledek měření může být reálně na opačné straně skutečné referenční meze.  

Rovněž je třeba si uvědomit, že interpretace laboratorních výsledků pomocí 95% intervalu referenčních hodnot je zároveň vyjádřením následující skutečnosti: i u zdravého jedince existuje 5% pravděpodobnost,  že jeho  výsledek bude nižší (2,5% pravděpodobnost), resp. vyšší (2,5% pravděpodobnost) než dolní, resp. horní referenční mez.

 

LITERATURA

1. Hendl, J.:. Referenční meze v klinické biochemii, ILF, Praha, 1987
2. Murray, R. K. Harperova biochemie. Praha : H & H, 2002.
3. Racek, J. Klinická biochemie. Praha : Galén, 2006.
4. Zima, T. Laboratorní diagnostika . Praha : Galén, 2002.
5. C28-A2. How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory. NCCLS 2000. Second edition.
6. Linnet K. Nonparametric estimation of reference intervals by simple and bootstrap-based procedures. Clin Chem 2000;46:867-9.
7. Baadenhuijsen, H. Smith, J.C. Indirect Estimation of Clinical Chemical Reference Intervals from Total Hospital Data. J.Clin.Chem.Clin.Biochem.Vol.23,1985,No.12