Kalibrace, kontroly kvality v koagulační laboratoři Kalibrační materiál Komerční kalibrační plazmy  přesně udaná hladina vyšetřované složky  naváznost na mezinárodní referenční materiály  některé parametry návaznost na „pool“ normální plazmu (aPTT, PT,..) Směsná normální plazma (PT, aPTT) Kalibrace1/ Vyšetření  Různých ředění kalibrační plazmy s udanou hladinou parametru(100%, 50 %, 25 %….)  Několika kalibračních materiálů s různou hladinou parametru  a vynesení naměřených hodnot (čas, A…) pro jednotlivé hladiny do grafu  Závislost lin/lin, lin/log, log/log,nelineární(polynom) 2/ Vyšetření referenčního času (času normálu) pro výpočet R, INR 3/ Načtení kalibrace čarovým kodem u předkalibrovaných metod Ředění kalibrační plazmy Automatické  naprogramováno Manuální Typy ředění Geometrickou řadou 100 % 100 % plazma (neředěná/ředěná) 50 % 1 díl 100% plazmy + 1 díl pufru 25 % 1 díl 50 % plazmy + 1 díl pufru 12,5 % 1 díl 25 % plazmy + 1 díl pufru 6,25 % 1 díl 12,5 % plazmy + 1 díl pufru Typy ředění Jiný způsob 1:1 100 % plazma (neředěná/ředěná) 100% 1:2 1díl 100% plazmy + 1 díl pufru 50 % 1:4 1díl 100 % plazmy + 3 díly pufru 25 % 1:8 1díl 100 % plazmy + 7 dílů pufru 12,5 % 1:16 1díl 100 % plazmy + 15 dílů pufru 6,25 % Kalibrační křivka Grafická závislost měřeného parametru na hladině vyšetřované složky měřený parametr (osa y)  koagulační čas (s)  absorbance (A, ΔA/min)….. hladina vyšetřované složky (osa x)  aktivita (%, IU/ml…)  koncentrace (g/l, g/ml…) Kalibrační křivka - požadavky minimálně tříbodová závisí na typu vyšetření musí pokrýt rozsah normálních i patologických hodnot linearita kalibrační křivky (ideální r = 1,00) pokud naměřená hodnota mimo kalibrovanou oblast v oblasti s klinickým významem je nezbytné opakovat vyšetření s jiným ředěním (menším nebo větším) vyšetřované plazmy Odečtení výsledku Automatické Manuální přímé odečtení  stejné ředění kalibrační i vyšetřované plazmy odečtení + vynásobení dilučním faktorem  odlišné ředění kalibrační a vyšetřované plazmy Provedení kalibrace při změně šarže setu při změně šarže jednotlivých reagencií, v případě že nejsou součástí jednoho setu po kalibraci musí následovat provedení kontrol kvality s deklarovaným rozmezím v normálním i patologickém rozsahu Kalibrace rutinních koagulačních vyšetření PT, APTT, Fbg, AT, D-DI Kalibrační materiál  komerční kalibrační plazmy  směsná normální plazma (PT, aPTT) Provedení kalibrace  při změně šarže setu  při změně šarže jednotlivých reagencií,  v případě, že nejsou součástí jednoho setu Kalibrace speciálních koagulačních vyšetření Kalibrační materiál  komerční kalibrační plazmy Provedení kalibrace  s každou sérií vyšetření vzhledem k omezené stabilitě reagencií a vysoké citlivosti  za obzvláště citlivé metody vyžadující kalibraci s každou sérií jsou považována vyšetření FF VIII, IX, XI a XII, PC a PS Typy kontrol Správnost/pravdivost Preciznost v čase/ reprodukovatelnost Preciznost v sérii/ opakovatelnost Porovnatelnost přístrojů/metod Požadavky na kontrolní vzorky Měření v jednom běhu současně se vzorky pacientů Analyzované složky musí být dostatečně stabilní Složení co nejvíce podobné vyšetřovaným vzorkům Zcela nezávislé na kalibračních materiálech Materiál nesmí být použit ke kalibraci analytických metod Kontrolní vzorky Firemní komerční plazmy (lyofilizované)  v referenčních mezích („normální“ – N) a mimo referenční meze (patologické – P)  atestované a neatestované Plazmy připravené laboratoří (čerstvé i zamražené po alikvotech)  „normální“ a patologické Kontrolní vzorky atestované Atestované (=certifikované) kontrolní materiály  Mají přesně udanou hladinu měřeného parametru s udáním povolených odchylek  Nutno použít více kontrolních vzorků s různou hladinou měřeného parametru, aby byl pokryt celý měřený rozsah  Odlišné hladiny nelze získat různým ředěním téhož kontrolního materiálu!!! Kontrolní vzorky neatestované Neatestované kontrolní materiály  komerční kontrolní materiály, které  nemají udanou hladinu měřeného parametru  mají uvedeno pouze  parametry, pro které je kontrolní materiál určen  orientační vymezení hladiny měřeného parametru  „normální“ a patologické Přesnost Vyjadřuje těsnost shody mezi naměřenou hodnotou a „pravou hodnotou“ udanou výrobcem kontrolního materiálu Kontrolní materiály s přesně udanou hladinou stanovované složky a s udáním povolených odchylek/rozmezí Přesnost Atestovaný komerční kontrolní materiál Použít minimálně dva nezávislé kontrolní vzorky  normální  patologický Odchylky/rozmezí uvedené na kontrolních materiálech nesmí být překročeny Pokud k tomu dojde, je nutné hledat příčinu a a celý běh analýz včetně analýzy kontrolního vzorku zopakovat Přesnost Rutinní koagulace  při změně šarže reagencie  po kalibraci  1x měsíčně minimálně Speciální koagulace  po kalibraci  s každou sérií vyšetření Přesnost Vyhodnocení  porovnání s deklarovanými hodnotami Vedení protokolů  výsledky měření  deklarované rozmezí  autorizace  schválení Preciznost je vyjádřením těsné shody mezi výsledky opakovaných měření téhož vzorku číselným vyjádřením = směrodatná odchylka(SD) od aritmet. průměru (x) (xi - x)2 SD =  --------------- n-1 Preciznost relativní směrodatná odchylka = variační koeficient SD x 100 CV = ----------- (%) x Stanovení preciznosti Opakovaná analýza stejného kontrolního materiálu, který nemusí mít udaný obsah stanovovaných složek (neatestovaný kontrolní materiál)  zajištění dostatečného množství kontrolních vzorků  zajištění stability vyšetřovaných parametrů Stanovení preciznosti Preciznost metody v sérii  je to souhlas mezi výsledky opakované analýzy téhož kontrolního vzorku, analyzovaných opakovaně (např. 10x) stejnou metodou ve stejném čase Preciznost metody v čase  liší se od přesnosti v sérii tím, že se kontrolní vzorek analyzuje každý den v provozních podmínkách současně s ostatními vzorky Preciznost v čase/reprodukovatelnost Rutinní koagulace (PT,APTT,Fbg,TČ,AT)  Kontrolní materiál  komerční neatestovaný  připravený laboratoří  Vhodné dva kontrolní vzorky  N  P  Provádět minimálně 1-2x denně  před zahájením denního provozu (a před pohotovostní službou)  pro každý parametr  pro každý přístroj, který je v provozu Preciznost v čase - vyhodnocení Statistické programy  koagulační automat  LIS  samostatné  výstup na Levey - Jenninsonovy grafy Westgardova pravidla  není běžné Preciznost v čase - vyhodnocení Nutno provádět průběžně  průměr, SD, CV (%CV doporučené nebo vlastní)  kontrolní rozmezí (průměr ± 2 SD)  varovné rozmezí maxim.(průměr ± 3 SD) Preciznost v čase - vyhodnocení Pokud výsledek mimo povolené meze  musí se najít příčina a celou sérii včetně kontrol zopakovat Pokud výsledky na jedné straně od x nebo vykazují stoupající nebo klesající trend, velký rozdíl oproti předchozímu výsledku...  je nutno analytickou metodu opravit Preciznost v čase/reprodukovatelnost Vedení protokolů  průběžně  výsledky měření, kontrolní a varovné rozmezí,CV, autorizace, schválení  závěr (šarže kontroly, reagencie, kalibrace)  CV, (počet překročení kontrolního rozmezí) Primární dokumentace  tisk výsledků kontrol, grafů Kontroly preciznosti pro AT - N 54,4 69,4 84,4 99,4 114,4 129,4 144,4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kontroly preciznosti AT - P 15,1 31,7 48,3 64,9 81,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Preciznost v čase/reprodukovatelnost Speciální koagulace  Kontrolní materiál  komerční atestovaný  v případě více měření v rámci kontroly přesnosti  připravený laboratoří  provádět s každou sérií vyšetření Vyhodnocení  průměr, SD, CV (%CV doporučené nebo vlastní)  kontrolní rozmezí (průměr ± 2 SD) Preciznost v sérii /opakovatelnost Nepatří mezi běžné kontroly v koagulaci Provádí se  při validaci přístroje  pro ověření správné funkce přístroje  při zavádění nových metod Počet měření 5 – 10 Vyhodnocení  průměr, SD, CV (%CV doporučené) Porovnatelnost přístrojů Rutinní koagulace (PT,APTT,Fbg,AT)  Čerstvě odebrané vzorky pro dané parametry (N a P)  vzorky změřit 1x denně na všech přístrojích,které jsou v provozu  Komerční atestované kontroly (N a P)  vzorky změřit na všech přístrojích  po kalibraci  při změně šarže reagencie Vyhodnocení  CV (%CV doporučené nebo vlastní) Porovnatelnost přístrojů Speciální koagulace  běžně se nedělá vzhledem k provádění kalibrace s každou sérií vyšetření  neprovádí se u všech speciálních testů Vyhodnocení  CV (%CV doporučené nebo vlastní)