IMUNOESEJE IMUNOESEJE • •tyto metody využívají vazebné reakce mezi protilátkou a ligandem (antigenem), informace o vazbě je zprostředkována pomocí značek •množství značené komponenty v imunokomplexu je závislé na koncentracích výchozích neznačených komponent. PŘÍMÉ NEPŘÍMÉ KOMPETITIVNÍ NEKOMPETITIVNÍ HOMOGENNÍ NEHOMOGENNÍ •Přímé -kvalitativní metodika k průkazu antigenu -Ag – Ab* • • •Nepřímé •- průkaz protilátek v séru •- Ag – Ab – Ab* •Kompetitivní -limitované množství reaktantu (protilátka), aby mohlo docházet ke kompetici -značený i neznačený ligand soutěží o vazebná místa protilátky -neznačený antigen blokuje vazbu značeného antigenu, množství vzniklého produktu je nepřímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku -čím víc se naváže značeného ligandu, tím méně neznačeného - • • • • •Nekompetitvní (sendvičová) -protilátka je v nadbytku, všechen analyt je vyvázán -analyt je vázán mezi dvěma specifickými protilátkami -množství vzniklého produktu je přímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku - • http://imunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/imunoreakce.pdf •Homogenní •- není potřeba oddělovat Ab-Ag od volného Ag* • •Heterogenní •- jedna z komponent je navázána na pevnou fázi •- nutnost separace navázaných složek reakce od volných složek reakce (detekční protilátka, konjugát) http://www.scielo.br/img/revistas/bjce/v26n2/a01fig01.jpg IMUNOESEJE ENZYM vizualizace sekundární fáze interakce AgxAb navázanou značkou: RADIOIZOTOP FLUOROCHROM LUMINOFOR RIA -kompetitvní heterogenní metoda -oddělení nukleární medicíny • -detekce reakce Ag-Ab pomocí radioaktivního izotopu jako značky navázané na jednu ze složek reakce , nejčastěji 125I -měří se intenzita radioaktivního zářiče – není třeba přidávat substrát • -vyšetřování hladin různých hormonů a jejich metabolitů, vitamínů a jejich metabolitů, specifického IgE, některých autoprotilátek – např. vyšetření Ab proti acetylcholinovému rec. při myastenia gravis • •FIA – jako značka se používá molekula fluorochromu, detekce signálu se provádí fluorimetricky • •LIA – značka – luminofory (při oxidaci vyzařují světlo), detekce na luminometru • př. bioluminiscence - oxidace luciferinu (enzym luciferáza) oxyluciferin a světlo světélkování světlušek http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=0F9857EB-03B8-09C9-42AE-63226C2FDFCA EIA •kovalentní vazba enzymu na některý z reaktantů •heterogenní uspořádání – skupina metod ELISA • (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) • ELISA-schéma http://virus.usal.es/web/demo_microali/enterotoxina/set.html 1.Potažení jamek antigenem 2.Přidání vzorku séra 3.Přídání enzymem značené protilátky(např. anti-human IgG) 4.Přidání substrátu 5.Odečtení barevné reakce 1 2 3 4 • 4. Ab s enzymem – křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, beta galaktozidáza,… • 5. substrát – např. tetrametylbenzidin 6. barevný výsledek 7. hodnocení…kalibrace, cut-off limity 1.“kautování“ prázdná jamka Ag polystyrén Ab …následuje 2.blokování, 3. nanesení vzorků, atd… EIA-ELISA I •1 reaktant imobilizován na povrch destičky •detekovaný antigen musí mít 2 různé epitopy •výsledkem je přeměna bezbarvého substrátu na barevný rozpustný produkt – tato přeměna pomocí enzymu na Ab •čím ↑ intenzita zbarvení, tím ↑ koncentrace zjišťovaného Ag ve vzorku •zabarvení se zjišťuje spektrofotometricky ELISA reader EIA-ELISA II •nejen kvalitativní, ale i kvantitativní metoda •lze stanovovat Ab i Ag (pozor na pojmy!!) •k průkazu látek s nízkou koncentrací ve vyšetřovaných vzorcích v mikrobiologické serologii a imunologii: • specifických Ab •Antivirových •Antibakteriálních •Autoprotilátek • nebo Ag