Stanovení nízkých hladin IgM v lidském séru metodou ELISA

                             (imunoesej – EIA – nekompetitivní ELISA)


Teorie:

   Hladiny celkových imunoglobulinů G, A, M se v laboratoři běžně měří nefelometricky. U
imunodeficientních pacientů se často stává, že hladiny těchto protilátek leží pod mezí detekce
nefelometru. Ten nám nahlásí hodnotu IgM < 0,05 g/l nebo třeba IgA < 0,01 g/l. V tomto případě nás
zajímá, jestli má pacient 0,049 g/l celkového IgM a nebo zda jeho hladina je téměř nulová.

   Metoda ELISA slouží k průkazu protilátek i antigenů nízkých koncentrací.

Na pevnou fázi (povrch jamek mikrotitrační destičky) se naváže příslušný antigen, přidá se
vyšetřované sérum, ve kterém chceme prokázat protilátky. Pokud jsou tyto protilátky přítomny,
naváží se na antigen a při následném promytí nedojde k odplavení. V další fázi přidáme konjugát,
tj. protilátku proti lidkým globulinům značenou enzymem křenovou peroxidázou. Tento konjugát se
naváže na komplex antigen – protilátka, vzniklý v první fázi reakce. K vizualizaci enzymové
aktivity peroxidázy použijeme tzv. substrát. Za přítomnosti sledovaných protilátek dojde ke
zbarvení obsahu jamek. Množství produktu enzymové reakce vyhodnotíme fotometricky při vlnové délce
450 nm na ELISA – readeru.


Provedení:


 1. Potažení jamek mikrotitrační destičky:
  + 18 ml králičí protilátky namířené proti lidské IgM protilátce + 12 ml potahovacího roztoku o pH
9,6
  + pipetovat 100 ml tohoto připraveného roztoku do každé jamky mikrotitrační destičky NUNC
  + nechat inkubovat 2 – 3 noci při 4 ^oC ve tmě


 2. Promytí:   3x promýt roztokem Tris-NaCl-Tween


3.      Blokování:   100 ml blokovacího roztoku Tris-NaCl-BSA do každé jamky,

inkubace 1,5 h při 37 ^oC


 4. Promytí:   3x promýt roztokem Tris-NaCl-Tween


 5. Kalibrace:   - viz schéma:
















 6. Pozitivní kontrola:   - viz schéma:













 7. Negativní kontrola:   ředící roztok Tris-NaCl-BSA


 8. Ředění sér:   - viz schéma:











9.      Pipetovat:   v dubletech: 100 ml na jamku dle pipetovacího protokolu a inkubovat 2 h při 37
^oC


10. Promytí:   3x promýt roztokem Tris-NaCl-Tween


11. Konjugát:

·        20 ml králičí protilátky (namířené proti lidské IgM protilátce) s křenovou peroxidázou +
12 ml ředícího roztoku Tris-NaCl-BSA

·        pipetovat 100 ml na jamku

·        inkubovat 60 min. při pokojové teplotě ve tmě


12. Promytí:   3x promýt roztokem Tris-NaCl-Tween


13. Substrát:

·        4 ml substrátu TMB + 8 ml PBS o pH 7,6

·        pipetovat 100 ml na jamku

·        inkubovat 7 min. při pokojové teplotě ve tmě


14. Stop činidlo:   100 ml do každé jamky 1 M H[2]SO[4]


15. Reader:   450 nm (program č. 57 IgME)


16. Výsledky:   v mg/l


Ref. rozmezí   nad 13 roků:     0,46 g/l – 3,04 g/l   IgM