Úloha č. 10


                              Burst test (test oxidačního vzplanutí)


Teorie:


Test je využíván ke kvantitativnímu vyhodnocení oxidačního vzplanutí u granulocytů a monocytů
v heparinizované plné krvi.

Fagocytující buňky se stimulují opsonizovanými E.Coli, fMLP (N-formyl-Met-Leu-Phe) nebo PMA
(phorbol-myristát-acetát). Dochází k oxidačnímu vzplanutí, při kterém se tvoří peroxidy,
hydroxylové radikály, superoxidové anionty, které oxidují membránově permeabilní fluorogenní
substrát DHR 123 (dihydrorhodamin 123) na zeleně fluoreskující rhodamin 123. Počet (procento)
zeleně fluoreskujících granulocytů a monocytů sledujeme na průtokovém cytometru.



Provedení:


 1. Plnou krev odebranou do heparinu rozpipetovat po 100µl do 4 zkumavek.
 2. Všechny zkumavky dát na 5 min do ledové lázně.
 3. Připravit roztok PMA – k 16µl rozmraženého PMA přidat 270µl PBS pro Burst test.
 4. K vychlazené krvi ve čtyřech zkumavkách pipetovat:


 a. zk.č.1 – 20µl PBS pro Burst test
 b. zk.č.2 – 20µl rozmraženého alikvotu E.Coli
 c. zk.č.3 – 20µl fMLP
 d. zk.č.4 – 20µl PMA


 5. Promíchat.
 6. Všechny zkumavky inkubovat 10min ve vodní lázni při 37°C.
 7. Naředit DHR – Nechat rozmrznout zkumavku s 45µl DHR, přidat 450µl PBS pro BT, důkladně
promíchat na Vortexu.
 8. Dát vychladit PBS tak, aby byl ledový, ale ne zmrzlý.
 9. Po ukončení inkubace přidat ke všem zkumavkám 30µl naředěného DHR. Důkladně promíchat na
Vortexu. Nechat inkubovat 10min ve vodní lázni při 37°C.
10. Přidat ke každé zkumavce 2ml ledového PBS pro BT. Centrifugovat 2000ot/5min.
11. Slít supernatant, sediment rozmíchat na Vortexu a lyzovat na lyzátoru.
12. Do odečtení uchovávat v ledničce.
13. Odečíst na průtokovém cytometru.


Ref. rozmezí:


Aktivace pomocí          E. Coli u         granulocytů:      80%

                                                           monocytů:        40%

                                    fMLP u           granulocytů:      <10%

                                                           monocytů:        <10%

                                    PMA u            granulocytů:
>95%